h*******0
发帖数: 14 | 1 Qiagen的柱子主要是回收10kb以下的。加1倍体积的isopropanol并不能帮助回收这样大
的质粒（试过）。你试过这么大的质粒么？谢谢。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 2 最近在想构建一个整合型质粒,怎么也想不明白.都说是整个质粒线性化以后会整合到宿
主菌中的基因组中.可我老觉得很容易二次重组把整合的片段弄丢了.把图附上,大家给
看看我哪儿想得不对.
非常感谢! |
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l*******6
发帖数: 90 | 3 要做transgenic mice
想只在大脑中表达，用什么样的启动子好?
推荐一个商业化或容易得到载体质粒载体
以前从一个Lab要过一个pNSE-EX4的质粒，可转化后菌都张不出来
这次我想直接从公司买
那么老大能给点信息或指点一下 |
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z****g
发帖数: 972 | 4 要求：
1.来源于Col-0的幼苗
2.经过了nomalization,减少了abundant transcripts,比如actin, tubulin等
3.host为普通E.coli,比如W3110或DH5a
4.所在质粒需为E.coli compatible的质粒，本身带有RBS (ribosome binding site)
5.可以受IPTG诱导直接在E.coli中表达
自己google了一堆，没找到合适的。如果板上哪位知道哪里可以购买，请pm |
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R*****w
发帖数: 447 | 5 把别人的试剂（知道肯定行的）借过来，自己再做一次。用试剂盒出不来还真是怪事。
要不就是你的细菌有问题，换个质粒试一下。这种情况我也遇到过几次，有时同时提的
几个质粒有的有，有的啥都没有。重新转化其他感受态细胞，再提又有了。 |
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p*****c
发帖数: 1506 | 6 不要用空质粒，
找一个这两个位点间有insert的质粒，酶切完以后跑胶，把大小不对没切完全的分掉 |
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s******y
发帖数: 28562 | 7 根据我自己的经验，这个并不确实。
有一个事情是，如果两个restriction site 距离得不是很远的话，有一个切了就会
影响到另外一个的切割效率，所以产物中会有一定比例的质粒是只被切了一刀的。
这种质粒会很容易被连接起来，所以不需要占产物的很高比例（即使只占1%）也能产生
很高的transformation effeciency. |
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m******5
发帖数: 1383 | 8 求教：
我在做一个做knock in mice用的大质粒（12k)
单酶切后是一条12k的线性化的带
但切胶回收后跑胶，12k的带变淡，却出现两条很浓的9k和6k的带。
实验室同学怀疑是star activity,但鉴于我跑的是切胶回收后产物，我怀疑是长质粒自
身缠绕形成的结构，跑得比较快
请教大家遇到过这种情况么？（再次强调酶切后跑胶只有一条带，6k和9k的带是胶回收
后跑胶时出现的） |
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M*****n
发帖数: 16729 | 9 什么细胞都没说，怎么回答？
所谓质粒是不是兼容，那是细菌里面质粒拷贝数控制的问题。
主里面复制？ |
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n**********s
发帖数: 228 | 10 刚engineer了一个bluescrppit 的质粒，大约17k，用Qiagen的常规大抽试剂盒，就是
过柱子那种，结果试了几次yield都很低，只有三十来微克，不知道原因是啥，同样的
试剂盒抽14k的质粒还好好的，
变懒了，上来问问大家这种stupid的问题，怎么能提高yield？换试剂盒还是自己配试
剂抽提？ |
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Z****o
发帖数: 999 | 11 换E.coli菌株吧，记得有一种菌株专门适合表达大的质粒，比如BAC，YAC库之类的。一
般的E.coli菌株表达12k以上的质粒都比较吃力。 |
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n**********s
发帖数: 228 | 12 不好意思是没详细说，
是连接克隆，转化用的XL-10 gold，扩增没有什么问题，小抽都能抽到质粒，鉴定也正
确。
唯一不同的是，小抽的时候没用Qiagen的miniprep柱子，因为抽不出来，我都是用的S1
TO S3 buffer加乙醇沉淀提出来的，10k以上的质粒我基本上用后者
现在想既然扩增没问题，是不是同样的方法大抽也可行？不过柱子是不是杂质很多？以
前听人说，很久前大家用什么纱布之类的用于大抽时过滤用？ |
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b**********8
发帖数: 349 | 13 如题，手上的一个真和表达质粒，据说是当初从Addgene买回来的，DH5alpha的菌液，
前段时间快用完了，用TOP10做了转化，使用invitrogen的midi prep kit提取中抽，产
量超低，几乎看不到沉淀，重复两次都一样，同一批操作的其它质粒都没问题，产量一
般在100ug左右。后来考虑是不是感受态不同导致，找别的组要了DH5alpha回来转化，
再提，还是没有改善，只能看到很少的一点点白色沉淀，现在正在airdry，估计产量也
就在几ug的水平，请问大家有没有遇到这个问题，该怎么解决呢？ |
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m******m
发帖数: 535 | 14 我有个同事不想提质粒
想问问哪里可以买到现成GFP质粒
做转染的positive control
Thanks |
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s*********y
发帖数: 387 | 15 处理了大概30个质粒，还有30-50个需要大提，
处理的30个中，主要是pCDNA和peGFP的质粒，插入大概3k 到 8k的基因片段
部分比较好，150ml菌，能有1000ng per ul浓度，有1ml体积
部分比较的诡异，浓度只有30 ng per ul，在1ml的体积中。
但是测序的 时候 都是 对的！！！！而且浓度低的 mini prep没有任何的问题
浓度在200 ng per ul，体积在 50ul |
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t*****z
发帖数: 1598 | 16 我也遇到过，某个常见的4kb左右的小质粒，大抽出来，总共100ul，浓度是150ng/ul。
抽了两次都是这样。看看质粒本身没什么特别的，不知道怎么回事。我觉得这事情和质
粒大小关系不大。你的也才大了一些些而已啊。 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 17 图在这里，看不到的点击链接啊：
[img]http://www2.picturepush.com/photo/a/6117040/img/6117040.jpg[/img]
我在琢磨大质粒的降解和构象变化的问题。这是一个大约17kb的质粒，大抽出来的，没有切过。最左边的是ladder，然后从左到右依次是冻在-20度的，藏在4度的和丢在室温的。过了五天拿出来电泳，看看降解得怎么样了。如大家所见，最左边的条带（-20度）看上去挺好，超螺旋和开环的分明。但是中间和右边的已经降解了，在超螺旋条带下面又多出一条细细的但是明显的小条带。请问谁知道这个小条带是怎么回事呢？
多谢啦！ |
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t*****z
发帖数: 1598 | 18 是这样啊。可是我刚刚抽提好的质粒，是没有这一条带的，放上几天才出现。是否放置
本身也会让质粒变性呢？
20 |
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s******y
发帖数: 28562 | 19 会。
至少有两个可能性：
1。完整的双链环状质粒是很稳定的，但是大质粒在提取的时候容易受损，
可能会在其中一条链上有缺口什么的，放在水中就慢慢会被降解。
2。提取的时候蛋白没有去干净，可能有少量核酸酶残留。特别是如果最后的
溶液里没有加EDTA的话就很容易被降解。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 20 求lentivirus质粒pLEX MCS
hygromycin resistant?
公司discontinue了，不知道能不能求到。我有些质粒可以交换。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 21 不同质粒之间会有不相容性，同一个质粒上应该没啥问题吧，而且用的都是同一套复制
系统。。。 |
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E***u
发帖数: 60 | 22 请教一下，在手上只有蛋白细胞表达质粒（以及其修饰点突变质粒）的情况下，怎么证
明某个修饰影响蛋白质turnover速率？
需要一个最直击要害最 convincing 的实验 |
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a***d
发帖数: 1998 | 23 我现在有个质粒，想用PCR的方法在target sequence两头加两个restriction sites，
然后再把target sequence切下来派用场。请问我必须作两次PCR，产物分别重提质粒，
最后酶切目标序列，与目标vector相连吗？
或者可不可以我只作一次PCR（用两个PRIMER），PCR产物直接酶切。再和目标vector相
连呢？ |
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b**********8
发帖数: 349 | 24 最近用sigma的PLKO.1-puro制备一个基因的shRNA慢病毒颗粒。于是想到这样一个问题
，到底什么样的质粒可以用来包装慢病毒呢？比如像pCDNA3.1这样的质粒，能不能包装
慢病毒从而提高转染效率呢？
可能有点白，但是还是很想知道权威的解释。多谢各位 |
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s******y
发帖数: 28562 | 25 能包装起来的质粒有所谓的packing signal region.
因为病毒蛋白会识别那个包装信号来决定要不要装一个东西。
普通质粒没有那一段序列，不会被装进去的 |
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s******a
发帖数: 472 | 26 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
所以现在唯一能确定的是转BAC DNA（我的约250kb）还是比普通质粒要难很多的。目前
对于lipo2000也已经没有idea了。
我现在开始尝试电转，第一次参数不合适细胞全死... 阅读全帖 |
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s******a
发帖数: 472 | 27 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
所以现在唯一能确定的是转BAC DNA（我的约250kb）还是比普通质粒要难很多的。目前
对于lipo2000也已经没有idea了。
我现在开始尝试电转，第一次参数不合适细胞全死... 阅读全帖 |
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d*******l
发帖数: 56 | 28 实验准备构建miRNA表达的质粒构建，有两个问题向大牛们请教
1）用pre-miRNA和pri-miRNA序列构建质粒，我发现文献上两者都有。两者哪个更好？
各有什么优点和缺点。
2）用genomic DNA做模板好，还是用RNA转换成cDNA做模板好？
第一次做，真心求教 |
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x*****o
发帖数: 441 | 29 我之前也是用一个师兄留下的质粒,在ecoli里面怎么也不表达,测序也是对的.
后来就酶切,发现那个质粒很小,不是普通的,在ecoli里面用得pET. 后来我就把那个片
段切下来,连到pET上面,再筛选,就表达了.
不过你切下来又连的也不行应该跟我的问题不一样. 测序试试吧.
有的人走之前就是会留下很多烂东西......... |
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j******n
发帖数: 941 | 30 用的Origene pCMV6-Entry的骨架
发现这个骨架本身用Zymo的z competent转化效率就特别低 怀疑是低拷贝质粒
5ul质粒+50ulcompetent也只能长出十来个克隆
可是用这个骨架酶切后与目的基因PCR酶切产物做T4连接后更死活长不出克隆来
请问大家有啥建议？换competent？哪个公司的DH5a转化效率更好些？ |
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y*********u
发帖数: 183 | 31 问问，这种transgenic mice常用组件质粒哪里有卖啊？
搜了半天搜出来一堆老鼠，没有质粒 |
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c****d
发帖数: 501 | 32 是这样
从质粒1里边扩增片段A
从质粒2里边扩增片段B
然后把A和B连起来 再接到vector里边
其中片段A还比较大
现在就一个mutation 所以我想如果有简单办法correct的话
就不用重新来一遍了 |
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j***y
发帖数: 1640 | 33 俺好不容易从比别人那里讨来了一个vector, 一看是滴在 一个小圆形的 filter
paper 上的， 俺是新手误以为该质粒是在Ecoli 菌内， 就把它放到 5ml LB 管内一小
时后， 取50 uL 上清 涂平板， 过夜什么都没有涨出来。 俺才意识到，别人寄过来的
是质粒， 不是菌株。
俺把这小块滤纸融在5mL LB 里面了， 这个还有补救的办法么？ |
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j***x
发帖数: 1469 | 34 我想跟踪这篇文章，因为覆盖了我们的领域，其中的RNA-seq， ChIP-seq 对我们的领
域有不小的帮助。 我想自己合成shRNA， 一blast发现， 质粒是错的，两个基因缩写
一样！！！
这种情况怎么处理？
给Nature写信， 肯定撤稿吧？ 因为质粒是错的，敲的是别的东西， 缩写是一样的。 |
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j***x
发帖数: 1469 | 35 这是个control shRNA质粒，所有的升高，降低都是以这个质粒为基准。 |
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z*******6
发帖数: 679 | 36 确实，我也觉得明显说反了啊... 超螺旋的未酶切质粒跑的比线性化的质粒快...
还有就是maxi-prep做的不好的时候，跑胶会看到两条带，一条超螺旋的跑得快的带，
另外一条应该是没有超螺旋的（这个我不太确定）... |
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n****0
发帖数: 696 | 37 如图，lane1是marker，lane 2 3 6 7 是单酶切，lane 4 8 是双酶切，lane 5 9是没
有酶切的对照。我提了两个质粒，是一样的。
另外我的其中一个单酶切好像不完全，也有一个很大的带。难道我的质粒结合了什么别
的东西？
smear |
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K**R
发帖数: 193 | 38 我最近用普通转染 类似于lipofectamine， 转染过表达和敲出质粒。
我发现过表达后的目的基因倍数增加比较大，而敲出后的减小倍数不是特别大。这个正
常吗？
我想问问大牛们你们一般转染后，目的基因表达倍数大概最大能达到多少倍变化啊？
谢谢了！ |
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s*****u
发帖数: 407 | 39 要了一个PROMOTER的质粒，发现promoter的５＇和３＇是反着的。就是５＇变成了３＇
，３＇变成了５＇（有测序的证据）。而且这个错的质粒发了好多文章了。有鼻子有眼
的，怎么办？ |
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m****M
发帖数: 360 | 40 最近在筛选那个片段的knockdown效率最高。现在有将近上百个
片段（质粒）要筛选。原来少的时候都是用MIDI提取后，做细胞转化，再做QPCR来筛选
。现在上百个样品，都这样工作量大不说，还特别浪费。大家给推荐个小提质粒可以用
来转化细胞的KIT。谢谢 |
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m****M
发帖数: 360 | 42 谢谢各位的回复非常感谢。谢谢TYZHET细心指点用词不当。是的应该是转染（
transfection）。
用bead提质粒太贵，操作还不方便。
刚刚定了那个qq007哥们推荐的提质粒和Gel/PCR二合一kits。和Qiagen的相比便宜很多
，将近一半。有了测试结果给大家汇报一下。 |
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B****n
发帖数: 22 | 43 说一点我的经历，或许对楼主有帮助
我去年也在大提pLKO质粒遇到同样的问题，产量很低。因为当时有人警告我说这个质粒
拷贝数很低要摇很多菌，所以我先挑一个单菌落放在5ml培养基里过夜摇，然后转到1L
的大瓶里放大。结果很悲惨。
后来发现没那么邪乎，直接挑一个单菌落放在250ml过夜摇就能提到1-2mg。
我建议：
1.每次都重新转化感受态
2.不要经过小摇，直接单菌落接种 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 44 talen质粒addgene上有好几个实验室提供，哪家的质粒好些？谢谢 |
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E*****e
发帖数: 54 | 45 就是一般的质粒如pEGFP－N1， 转到Hela或者293T里
还有一个问题是，质粒会随细胞分裂而复制吗？ 谢谢 |
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j****x
发帖数: 1704 | 46 这里我倒是还知道一个“唯二”的特例：
如果在哺乳动物表达质粒的转录单位后面接上一段nuclear scaffold matrix
attached region（SMAR序列），那么该质粒就可以在不需要真核复制起始位点的情况
下以episome的形式存在并跟随基因组染色体在细胞分裂的过程中自我复制无需任何其
他条件。这种情况下的组蛋白的结合和修饰都是存在的，但有其特殊性。 |
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c********b
发帖数: 363 | 47 起码在植物里不是这样。
不能进细胞核的质粒很难表达，因为很难接触转录酶系。植物病毒的DNA（和环状质粒
差不多）有时会进细胞核并被histone包裹 |
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j****x
发帖数: 1704 | 48 大于300bp的质粒入核需要跨越核膜的屏障，简单说来，可能存在2种“常见”机制，尽
管实际情况会复杂的多。
1. 对于dividing cells，细胞分裂过程中核膜解体，质粒得以进入核内，这属于“
passive nuclear importation”，没什么疑问。
2. 对于non-dividing cells，NPC介导的active transport则是可能的主要途径。这其
中plasmid上面的sequence-specific element以及某些host facotor都是必要的条件。
这一块的具体机制似乎还不是完全清楚，但有证据表明，这一途径存在明显的sequence
-dependent以及transcription-dependent的特性。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 49 弱弱地说一下，我记得plasmid进核基本是一定的，除了植物里importin alpha介导有
人已经说了，哺乳动物细胞是由importin T介导的（STH like that）
另外，我觉得可以做几个thought experiment
1,如果只有M phase plasmid才能趁着核膜解体进核，那酵母里转染基本是mission
impossible了（因为酵母核膜不解体）。
2，如果只有M phase plasmid才能进核，我们转染293T是不可能在24小时后达到80%的
transfection efficiency without doubled cell number.
3,如果M phase plasmid才能进核，是否表达外源质粒早就会被发展成鉴定是否post -
mitotic cell的标准了。
…………我觉得还有很多例子。
最后弱弱地说一下，我之所以想到这些粒子，因为我似乎看到过把质粒转进去再pull
down下来看sequence specific histon deposition的，啊哈哈 |
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j****x
发帖数: 1704 | 50 plasmid在非分裂期通过NPC入核当然是可能的，但是需要特定的DNA序列支持，比如
SV40 ori或者NLS bingding sequence的存在，importin介导的质粒入核不是无条件的
，这点已经非常明确了。真核表达质粒往往都会包含这些sequence element,所以会让
人产生错觉，觉得是理所应当的，其实不然。
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