b**********8
发帖数: 349 | 1 如题，手上的一个真和表达质粒，据说是当初从Addgene买回来的，DH5alpha的菌液，
前段时间快用完了，用TOP10做了转化，使用invitrogen的midi prep kit提取中抽，产
量超低，几乎看不到沉淀，重复两次都一样，同一批操作的其它质粒都没问题，产量一
般在100ug左右。后来考虑是不是感受态不同导致，找别的组要了DH5alpha回来转化，
再提，还是没有改善，只能看到很少的一点点白色沉淀，现在正在airdry，估计产量也
就在几ug的水平，请问大家有没有遇到这个问题，该怎么解决呢？ |
m*********7
发帖数: 606 | 2 我建议你先小提看看。
见过一个很极端的例子，某个质粒小提时没有任何问题，一扩大培养基体积细菌就产不
了多少质粒。那个实验室每次提质粒时就只好上１００个试管，再合起来提；或者铺一
大块琼脂培养基，等菌苔长满再刮下来提。
那个实验室的PI和别人讨论觉得可能是插入序列有未知潜在抑制作用，但谁也不知道原
因，只好先这么做了。
另外，很早以前有些老质粒是需要在培养过程中用 IPTG诱导的。你看看质粒信息是否
有这种可能性存在。 |
r***e
发帖数: 2539 | 3 这种情况遇到过，降到温度可能有效。
好像质粒自己重组了。
【在 m*********7 的大作中提到】
: 我建议你先小提看看。
: 见过一个很极端的例子，某个质粒小提时没有任何问题，一扩大培养基体积细菌就产不
: 了多少质粒。那个实验室每次提质粒时就只好上１００个试管，再合起来提；或者铺一
: 大块琼脂培养基，等菌苔长满再刮下来提。
: 那个实验室的PI和别人讨论觉得可能是插入序列有未知潜在抑制作用，但谁也不知道原
: 因，只好先这么做了。
: 另外，很早以前有些老质粒是需要在培养过程中用 IPTG诱导的。你看看质粒信息是否
: 有这种可能性存在。
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w******n
发帖数: 767 | 4 买过一个addgene的质粒，小提提不出来，大提才行。
【在 b**********8 的大作中提到】
: 如题，手上的一个真和表达质粒，据说是当初从Addgene买回来的，DH5alpha的菌液，
: 前段时间快用完了，用TOP10做了转化，使用invitrogen的midi prep kit提取中抽，产
: 量超低，几乎看不到沉淀，重复两次都一样，同一批操作的其它质粒都没问题，产量一
: 般在100ug左右。后来考虑是不是感受态不同导致，找别的组要了DH5alpha回来转化，
: 再提，还是没有改善，只能看到很少的一点点白色沉淀，现在正在airdry，估计产量也
: 就在几ug的水平，请问大家有没有遇到这个问题，该怎么解决呢？
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S******e
发帖数: 393 | 5 我也碰到过这样的问题，挺烦人
其他人也说了，1）试试miniprep; 2)降低培养温度
【在 b**********8 的大作中提到】
: 如题，手上的一个真和表达质粒，据说是当初从Addgene买回来的，DH5alpha的菌液，
: 前段时间快用完了，用TOP10做了转化，使用invitrogen的midi prep kit提取中抽，产
: 量超低，几乎看不到沉淀，重复两次都一样，同一批操作的其它质粒都没问题，产量一
: 般在100ug左右。后来考虑是不是感受态不同导致，找别的组要了DH5alpha回来转化，
: 再提，还是没有改善，只能看到很少的一点点白色沉淀，现在正在airdry，估计产量也
: 就在几ug的水平，请问大家有没有遇到这个问题，该怎么解决呢？
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b**********8
发帖数: 349 | 6 多谢楼上各位分享经验。看到有人建议用miniprep，可是我要用这个质粒做转染，
miniprep的产物可以直接转染吗？
另外，降低温度可能有效，这个温度有没有具体的范围呢？室温？30度？我昨天晚上又挑了一个放在室温下摇过夜，今早来看发现培养液清亮，应该是没涨起来，刚才又把温度加到30度了，不知道行不行。 |
w******n
发帖数: 767 | 7 抗生素浓度加倍，培养时间加倍，培养体积10倍，然后大提。
【在 b**********8 的大作中提到】
: 如题，手上的一个真和表达质粒，据说是当初从Addgene买回来的，DH5alpha的菌液，
: 前段时间快用完了，用TOP10做了转化，使用invitrogen的midi prep kit提取中抽，产
: 量超低，几乎看不到沉淀，重复两次都一样，同一批操作的其它质粒都没问题，产量一
: 般在100ug左右。后来考虑是不是感受态不同导致，找别的组要了DH5alpha回来转化，
: 再提，还是没有改善，只能看到很少的一点点白色沉淀，现在正在airdry，估计产量也
: 就在几ug的水平，请问大家有没有遇到这个问题，该怎么解决呢？
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m*********7
发帖数: 606 | 8 为啥小提的产物不能直接做转染？你以为别人提１００个试管小提的产物是干嘛用的？
又挑了一个放在室温下摇过夜，今早来看发现培养液清亮，应该是没涨起来，刚才又把
温度加到30度了，不知道行不行。
【在 b**********8 的大作中提到】
: 多谢楼上各位分享经验。看到有人建议用miniprep，可是我要用这个质粒做转染，
: miniprep的产物可以直接转染吗？
: 另外，降低温度可能有效，这个温度有没有具体的范围呢？室温？30度？我昨天晚上又挑了一个放在室温下摇过夜，今早来看发现培养液清亮，应该是没涨起来，刚才又把温度加到30度了，不知道行不行。
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j****x
发帖数: 1704 | 9 小提有可能纯度不够，某些敏感细胞系内毒素等除不干净的话影响很大。
当然，也可以先小提之后再集中纯化一次
【在 m*********7 的大作中提到】
: 为啥小提的产物不能直接做转染？你以为别人提１００个试管小提的产物是干嘛用的？
:
: 又挑了一个放在室温下摇过夜，今早来看发现培养液清亮，应该是没涨起来，刚才又把
: 温度加到30度了，不知道行不行。
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O******e
发帖数: 4845 | 10 the quality is lower
【在 m*********7 的大作中提到】
: 为啥小提的产物不能直接做转染？你以为别人提１００个试管小提的产物是干嘛用的？
:
: 又挑了一个放在室温下摇过夜，今早来看发现培养液清亮，应该是没涨起来，刚才又把
: 温度加到30度了，不知道行不行。
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s******s
发帖数: 13035 | 11 qiacube做出来的小提质量很好，不知道是什么trick
【在 O******e 的大作中提到】
: the quality is lower
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s******s
发帖数: 13035 | 12 经典方法是直接摇1L，长到对数期的时候加点氯霉素抑制细胞分裂，
然后过夜。这样菌体可能和200ml的普通生长差不多，适合中大提，但
是质粒会累积很多
又挑了一个放在室温下摇过夜，今早来看发现培养液清亮，应该是没涨起来，刚才又把
温度加到30度了，不知道行不行。
【在 b**********8 的大作中提到】
: 多谢楼上各位分享经验。看到有人建议用miniprep，可是我要用这个质粒做转染，
: miniprep的产物可以直接转染吗？
: 另外，降低温度可能有效，这个温度有没有具体的范围呢？室温？30度？我昨天晚上又挑了一个放在室温下摇过夜，今早来看发现培养液清亮，应该是没涨起来，刚才又把温度加到30度了，不知道行不行。
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