H****s
发帖数: 301 | 1 往细菌里转了一个基因文库，发现了一个表型改变。似乎这个表型变化是不可逆的，挠
头中。我更感兴趣的是细菌的这个新表型。请问有没有什么办法去掉细菌里转进去的质
粒？这个质粒是基于pUC Ori的，是个高拷贝质粒。如果我在没有抗性的培养液中连续
传代，会不会彻底除去？谢谢。 |
|
L****T
发帖数: 169 | 2 你咋测定质粒浓度的？如果像你描述这样电泳结果，很可能大部分EB被前面的RNA结合
了，说不定你质粒的量其实还可以。另外肯定一点你大抽Kit的RNase不足。 |
|
r******k
发帖数: 446 | 3 我构建的质粒HA-NLS （nuclear localization sequence）- gene- flag。
好像表达了一个HA-NLS-gene-flag。 又表达了一个 gene-flag。 怎么办？ 把我要的
基因的atg pcr掉？重新做质粒？thank you！！！！ |
|
b**********8
发帖数: 349 | 4 如题，想验证下手上的这几个质粒，懒得自己设计了，请教各位谁知道这三个质粒的测
序引物序列，最好能把三个都测到的，谢谢！ |
|
d**********t
发帖数: 20415 | 5 addgene就是一个保管的中心，没有什么QA一说，谁submit的谁负责，addgene好歹自己
会去测个序，供买的人参考，如果让addgene保证质粒的质量，那他一个质粒估计至少
就要买500了，而不是现在的这个价格了
！！ |
|
r********s
发帖数: 149 | 6 从那里买过几十个，只有一个空载体好像不对。
[在 neveralone (have fun) 的大作中提到：]
：这个addgene的质量控制非常差，从它那里买10个质粒有1-2个work就不错了，尤其是
：library的质粒。先前买了这个Human GeCKO v2 Library (1 Plasmid System), 无论
是PCR，挑单克隆测序，或是按照文献去酶切，都不能准确得到sgRNA。而且，addgene的
：........... |
|
l***y
发帖数: 638 | 7 买到烂质粒的都打电话跟他家客服complain
找大牛老板去要求
等有闲工夫的兄弟造个网站专门让大家去写他家质粒reivew |
|
i*********0
发帖数: 915 | 8 lenti viral系统（amp resistence）的质粒，加上insert差不多10-12kb左右，小提用
自己配的p1,p2,p3，一点问题没有，酶切和测序都没有问题；但是从小提中取了700ul
，放到80ml做overnight culture，做中提（用的是qiagen的mid plus vacum的kit），
就怎么也提不出来质粒。
各位有没有啥建议？
谢谢！ |
|
I*****h
发帖数: 470 | 9 公司刚招了个老美小本
干活好像还蛮卖力
想交代一个小project给他做
哥们竟然不知质粒为何物，更不知染色体和质粒的区别
不知说啥好了 |
|
z*********s
发帖数: 38 | 10 最近用pCDNA 3.1+质粒表达蛋白，请问质粒是在哪个位置被切开加上polyA尾巴的，具
体是怎么样一个过程？ |
|
z*********s
发帖数: 38 | 11 我的问题可能没有问清楚，我想问的是对于pCDNA3.1质粒，polyA是加在质粒对应的哪
个位置的？ |
|
a*****e
发帖数: 33 | 12 什么意思？
确实碰到这问题才上来问的啊
隔行如隔山，我连质粒都是google之后才知道是什么。
真有风险我肯定不会冒险的，这不坑人吗
也不是很熟的朋友。
[在 apostle (apostle) 的大作中提到：]
：最近要回国，有朋友托我带质粒回去，存在小管里的，有9小管，本人非生物专业，不
：知这东西是不是敏感或机密材料？带回去会有风险吗？是美国安检会查还是中国海关
会查？需要冒险的话我是不打算带了
：........... |
|
a*****e
发帖数: 33 | 13 我都拒绝朋友不带了。
你tm还在这里纠结
你狗眼瞎了吗，我原帖里就说了本人非生物专业！
一开始朋友说让带滤纸后来送来了小管，我根本不知道里面有什么东西，她后来让我分
着藏鞋里托运，我才意识到有问题，追问之下才知道有质粒，google了才发现这种东西
有风险所以上来发帖询问。现在已经拒绝了。这就是全过程，他妈满意了吗？
还五毛，你全家都五毛。
你tm就是一心里阴暗的小人。
[在 apostle (apostle) 的大作中提到：]
：最近要回国，有朋友托我带质粒回去，存在小管里的，有9小管，本人非生物专业，不
：知这东西是不是敏感或机密材料？带回去会有风险吗？是美国安检会查还是中国海关
会查？需要冒险的话我是不打算带了
：........... |
|
D******e
发帖数: 18 | 14 各位朋友，大家好！我在美东马里兰州，最近注册成立了一个生物公司，想做一些有关
病毒的工作。我发现Addgene正提供很多有用的质粒，对此我很感兴趣。因为我们不是
non-profit，因此不允许从Addgene购买。不知各位朋友能否给帮一个忙，买一下，我
需要大概30个左右的质粒，可以分批买！我将付双倍价钱！有意者请站内私信给我！万
分感谢! |
|
发帖数: 1 | 15 大家好，我想向各位求助一个质粒。
最近我们实验室一个工作中需要在细胞内高表达PGC-1α (human)，但是大部分公司都
没有人源PGC-1α的质粒。想问一下各位谁有？
非常感谢！我在波士顿 |
|
|
发帖数: 1 | 17 细胞房污染了整个细胞房甲醛熏一下，怎么着几天也好了吧，这是所有的细胞都污染了
，连质粒估计也污染了。 |
|
t*****t
发帖数: 165 | 18 【 以下文字转载自 Pharmaceutical 讨论区 】
发信人: trueddt (a-mu), 信区: Pharmaceutical
标 题: 请问，国内病人的血液质粒样本，可以卖到美国吗？
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Oct 25 21:56:26 2015, 美东)
有在国内医院的朋友托我打听。。。说是他们那里有很多病人的血液样本，可以做成质
粒，卖到美国。
不知道大家有没有熟悉这一行的？ |
|
s*********u
发帖数: 2535 | 19 不久前发的一篇文章，共同一作，主要贡献是发现了一个蛋白用来检测某金属离子在细
胞内的浓度（独立贡献，老板没有参于设计这个idea）。
已经有几个实验室向我们要过质粒。不过发信都是发给了老板（通讯作者）。想吹一吹
自己的成果被别人应用。但是这些e-mail都没有发给我，是向老板要这些信的打印件呢
（但是收件人不是我），还是直接要老板写点什么证明一下呢？谢谢
另外奋斗了三个星期，终于收回了4封推荐信了，两封独立，两封非独立。都是针对同
一contribution的。下面还要准备另外两个贡献的推荐信，准备再要个3封左右吧。现
在已收回的4封信里面，有2封被推荐人（都是领域内牛人，40年以上的工作经历了）自
己加了自己的publication数量（我给的draft里面都没有提），还都是一两百以上。其
实我在e-mail里面跟他们明确说了，最好不要加他们自己的publication数量，可能会
对我的case不利。不知道他们没有看到还是觉得应该要加上，反正被加上了。这个怎么
处理比较好呢？用这些有他们文章数量的推荐信风险有多大？再次谢谢 |
|
p*****e
发帖数: 280 | 20 我也在考虑这个问题。管过我要东西的人多了去了，哪个月不寄个几次的，什么质粒，
细胞，蛋白，甚至老鼠，我都无偿的提供了。但是这些人肯定都是联系通讯作者的，信
也都是老板forward给我们的，也没在信里提Dr.xxx是作者/专家所以你该找it。所以我
觉得这些信本身不是很合适作为直接证据。
你问问搞EB1的律师什么的看看他们怎么说吧 |
|
M*****2
发帖数: 379 | 21 借帖顺便请教一下
一般这种要质粒的都是发给老板的，老板再forward给first author处理，这种情况也
可以用来claim么？
谢谢 |
|
s******y
发帖数: 17729 | 22 如果有很多这种要的信，你就算contribution，如果只有这一封，或者少数三两封，IO
就容易质疑你这个claim，问你提供更多的关于这个质粒被广泛应用，或者重要意义sup
port 材料。 |
|
p*****n
发帖数: 981 | 23 ☆─────────────────────────────────────☆
ttyy (26s) 于 (Wed Dec 20 21:45:00 2006) 提到:
用碱裂解法提取,用来转化YEAST. 实验室的PHENOL:CHLOROFORM:ISOAMYL ALCOHOL用完
了,如果直接用CHLOROFORM:ISOAMYL ALCOHOL 会不会提取得质粒质量很差,影响下一步?
另外,看到有人用CHLOROFORM:ISOPROPANOL, 请问ISOAMYL ALCOHOL 和ISORPOPANOL 在
这里有区别吗? ISOPROPANOL不时用来沉淀DNA的吗? 谢谢.
☆─────────────────────────────────────☆
sunnyday (艳阳天) 于 (Wed Dec 20 22:33:08 2006) 提到:
可以直接用chroloform, 提取两次以上，质量和phenol mix 做出来的差不多。
步?
☆─────────────────────────────────────☆
hellozero |
|
D***a
发帖数: 516 | 24 构建的质粒总有几个碱基测不出来，有时候是单个的，有时候是几个连在一起，应该不
是缺失突变了吧？ |
|
c****y
发帖数: 14 | 25 各位大侠, 高手：
紧急求助！
我想克隆一段非编码的人DNA序列（４kb左右）。请问在哪些公司可能买到含有人
类非编码DNA序列的DNA质粒？谢谢指点。 |
|
a****d
发帖数: 1919 | 26 能不能自己选一段基因组扩增，然后装到特定的载体里？
公司不会随便做这样的质粒吧，random的非编码序列没有市场啊 |
|
J********n
发帖数: 534 | 27 "用一般的Qiagen柱子胶回收不了这个酶切过的质粒"
why?
加1倍体积的isopropanol，就可以了吧。 |
|
|
h*******0
发帖数: 14 | 29 那你用什么方法大提质粒的？我用Qiagen的柱子却大提不出来，小提没问题，后来用
CsCl的老方法，提倒是提出来了，产量还是不高。请教一下。谢谢。 |
|
|
q*****d
发帖数: 445 | 31 我来回答你：以缺失基因的ORF为例
Chromosome: Promoter ORF Terminator
Plamsid: (Enzyme A) Promoter marker Termintator (Enzyme B)
你的质粒应该是这个上面的第二个结构，用A,B酶切之后，转化就OK了，你设计的结构
是很容易发现回复突变的，但是可以用Marker进行筛选。 |
|
h**********r
发帖数: 671 | 32 打扰了，实验紧急需要tac启动子，质粒我可以不用你的，只是要PCR其中启动子的序列。
可以用我的FeDex帐号。
多谢！ |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 33 毕业前没有写个inventory么？
我毕业前做的抗体、做的质粒、提的gDNA、保的菌种、定的引物。。。全部列了个
inventory的
怎么做的、收哪儿了，全写下来
老板问我要啥的时候直接告诉他在inventory上第几页。 |
|
e*******n
发帖数: 2178 | 34 最近做个克隆，做了两次，不成功。今天check一下问题在哪里，发现很奇怪。
质粒先内切酶处理，然后胶回收，取出5微升，得到sample 1.
然后用New England的Antarctic Phosphatase处理半个小时，取出5微升，得到sample
2.
然后65度5分钟灭活，取出5微升，得到sample 3.
电泳发现sample 1和2都有DNA条带，很明亮，sample 2稍弱，但是sample 3就啥都没有
了，连很弱的条带都没有。有TX知道这是什么问题吗？ |
|
e*******n
发帖数: 2178 | 35 最近做个克隆，做了两次，不成功。今天check一下问题在哪里，发现很奇怪。
质粒先内切酶处理，然后胶回收，取出5微升，得到sample 1.
然后用New England的Antarctic Phosphatase处理半个小时，取出5微升，得到sample
2.
然后65度5分钟灭活，取出5微升，得到sample 3.
电泳发现sample 1和2都有DNA条带，很明亮，sample 2稍弱，但是sample 3就啥都没有
了，连很弱的条带都没有。有TX知道这是什么问题吗？ |
|
o**i
发帖数: 1165 | 36 isopropanal 沉淀 离心以后 你能否看见DNA pellet？
如果没有 加入isop以后要震荡混匀 不能简单摇摇了事
用kit提质粒 出不来还真不多见啊 |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 37 ....我原帖都写清楚了吧，mini的很好用，midi的不行
都是P1,P2,N3
本来是因为质粒是low copy number，mini提，3ml只出来10ng/ul*30ul，
所以改用midi，不是现买的，以前实验室走了的人留下来的，但是P1,P2,我用的是Mini的
但是这样提50ml也只出来20ng/ul*100ul的样子
所以一气之下以后都是mini小提好几个，然后乙醇沉淀
就是很疑惑为什么mini好使，midi不好使，所以上来问问大家
另外现在实验室里没有谁midi用起来提得效果好的，都跟我一样的困惑，为什么mini好
用midi不好用 |
|
m***o
发帖数: 10232 | 38 先看看质粒是高copy还是低copy,copy高低不同，加入buffer量不同 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 39 最可能的原因时接种方法不对，导致medium里面amp被大量破坏，所以不长质粒。
可以试一下先长到2ml，离心下来然后再接种100－500ml,可能会好很多。 |
|
s********n
发帖数: 2939 | 40 我用的是QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit，效果很好，P3不用放4度，最后用100-200
ul的EB洗脱，low copy的质粒可以得到大概300-600 ng/ul，不用浓缩。 |
|
c****1
发帖数: 1095 | 41 酶切空质粒确实比较麻烦。我的经验是，一次酶切后，纯化，再酶切，再纯化，再酶切
。三轮过后，基本就没有没切开的了。
其实，插入片段也是个方法，你怕环状DNA跑的快，就插入个大点的片段，这个应该难
度不大。
BTW，为什么要这么大量？让我们开开眼？ |
|
g*****y
发帖数: 6325 | 42 为什么要这么高的浓度转化呢？ 我每次就切1ug. 胶回收，然后ligation, 转化都能挑
到正确得质粒。还有酶切一般我都不会
切超过2ug／tube. qiagen胶回收。 |
|
h*****9
发帖数: 4028 | 43 太高了。通常都是1-2ug/50ul。另外你的酶量加太多Glycerol可能会对酶切不利。
回收只要是跑胶纯化，未梅切质粒污染应该非常少。 |
|
x*****e
发帖数: 309 | 44 看来做酶切的人还不少。其实双酶切分两步应该可行，先用对酶切要求比较高（查NEB
附录上需要保护碱基较多的酶）的酶切，反应完后加直接加第二个酶切：不用回收DNA
。这里有人问buffer不同怎么办的问题，查查哪里不同，一般也就是NaCl浓度差异，缺
啥补啥，自己加点调成第二个酶用的buffer就可以了。我现在空质粒双酶切完直接乙醇
沉淀回收（小片段沉淀不下来？）：加2倍体积无水乙醇，可选加1/10体积3M醋酸钠，-
20度大于20分钟，14000rpm*15min回收DNA,70% 乙醇洗2遍，风干后10-20ul水溶解（1-
2 ug DNA），如果有大的插入片段就走胶回收吧。 |
|
A*******e
发帖数: 284 | 45 请问我两个酶有共用buffer，为什么还要分布切呢？ 空质粒双切后直接乙醇沉淀
后做克隆可以吗？ 这样没有背景？我决定切下拉的片断应该也能沉淀下，这样就会有
背景啊。愿闻其祥，请赐教啊。
曾有labmate双切后用PCR纯化试剂盒做回收纯化，一直不成功，我提醒说这样酶切
的片断也能回收回来，不要迷信回收试剂盒，什么多大的片断回收不下来之类的全不可
靠。后来换胶回收就成功了。
NEB
DNA
，-
1- |
|
x*****e
发帖数: 309 | 46 比如XhoI这个酶需要的保护碱基比较多，需要6-7个，XhoI NNNN EcoR1,两者之间间隔
很小，可以先XhoI切。如果同时切，XhoINNNN 这样的分子就可能XhoI切不了。空质粒
双切后，小片段也就几十个碱基，乙醇沉淀大概原理就是中和DNA负电荷，直觉小片段
应该不容易沉淀（物化忘光了，好像分子直径大于多少就不能形成溶液），在我做过的
试验中背景很少（不加Insert的阴性对照，几乎没有克隆长出），但是没有设计针对背
景的实验。 |
|
v**p
发帖数: 15 | 47 因为质粒比较多（上百种），放在滤纸上不方便。有没有可能直接放在管子里寄回去或
者放在行李箱托运回去？ |
|
m****g
发帖数: 2185 | 48 买本新书, 买个保鲜膜, 质粒放滤纸上, 滤纸用保鲜膜包一下夹书里, 在书页上标记一
下, 回国后剪吧剪吧溶解到EP管里. |
|
p******d
发帖数: 3737 | 49 原来实验室用的是Vector NTI，现在变得死贵，一个实验室还只能装有限的几台，大家
现在都用什么
软件保存质粒图谱呢？要是有免费又好用的就好了，唉。 |
|
p******d
发帖数: 3737 | 50 自己电脑里面没有备份比较麻烦吧。我也是要毕业了，有些质粒我想问问老板看能不能
带走呢。 |
|
