m****M
发帖数: 360 | 1 最近在筛选那个片段的knockdown效率最高。现在有将近上百个
片段（质粒）要筛选。原来少的时候都是用MIDI提取后，做细胞转化，再做QPCR来筛选
。现在上百个样品，都这样工作量大不说，还特别浪费。大家给推荐个小提质粒可以用
来转化细胞的KIT。谢谢 |
q***7
发帖数: 144 | |
m****M
发帖数: 360 | 3 非常感谢提供这么个信息。有RNA提取的柱子吗？如果有的话，RNA样品中也不含洗液吗
？我先定个质粒的看看。
【在 q***7 的大作中提到】
: 你可以试一试这个公司的小量质粒提取试剂盒。所提质粒不含洗液，可以用来做转化用
: 。效果非常好。要比Qiagen好多了。
: http://www.greenbioresearch.com/plasmid-dna-isolation-miniprep-
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q***7
发帖数: 144 | |
q***7
发帖数: 144 | 5 你如果用的是Qiagen 或其他公司的柱子提的RNA，那你有没有考虑过RNA样品中的洗液
的影响？
尤其是RNA浓度低的样品。因为要调成和浓度高的样品一样的总量，所以要加的比较高
的体积。这样在反转录体系中这个低样品的洗液就多，抑制反转录酶的活性很强。所以
你虽然放了一样多的总RNA，但是大多都没有被反转录。当你所qPCR时，你这个样品的
Ct值会很高，意思就是表达很低。所以就是给你表达低的假现象。你做qPCR时，可以留
意一些低浓度样品的Ct值。很多人发表的qPCR的文章后来表明结果相反，有一些原因是
这些研究者没有考虑这个原因。
这是我给另外一个贴子的回复
Qiagen柱子提取的RNA总是含很多的洗液。后面会影响到反转录酶的活性。如果每个样
品的浓度不一样，你做qPCR时，要调成一样的浓度，这样你做反转录的每一个样品的反
应液里含有的洗液浓度就不一样。不一样的洗液浓度，抑制反转录酶的程度也不一样。
这样你最后出来的qPCR结果肯定不准确。有的样品里表达低，可能是因为洗液多而抑制
了反转录酶造成的，而不是真正的表达低。如果你同一组的样品，有的表达高，有的表
达低，一般都是这个原因造成的. 建议你试一试这个公司的KIT，而且还可以同时检测
小RNA。便宜又好用
http://www.greenbioresearch.com/mitotal-rnamini-using-qiagen-ki |
s******s
发帖数: 13035 | 6 用过最好的是roche的magna，应该是beads-base的，所以比较干净
【在 q***7 的大作中提到】
: 你如果用的是Qiagen 或其他公司的柱子提的RNA，那你有没有考虑过RNA样品中的洗液
: 的影响？
: 尤其是RNA浓度低的样品。因为要调成和浓度高的样品一样的总量，所以要加的比较高
: 的体积。这样在反转录体系中这个低样品的洗液就多，抑制反转录酶的活性很强。所以
: 你虽然放了一样多的总RNA，但是大多都没有被反转录。当你所qPCR时，你这个样品的
: Ct值会很高，意思就是表达很低。所以就是给你表达低的假现象。你做qPCR时，可以留
: 意一些低浓度样品的Ct值。很多人发表的qPCR的文章后来表明结果相反，有一些原因是
: 这些研究者没有考虑这个原因。
: 这是我给另外一个贴子的回复
: Qiagen柱子提取的RNA总是含很多的洗液。后面会影响到反转录酶的活性。如果每个样
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t****t
发帖数: 86 | 7 请问您这评论有conflict of interest吗？
楼主虽然写的是转化(transformation),但说的应该是转染(transfection).这个kit提
的质粒能用来做转染吗？产品介绍上反正是没说。
【在 q***7 的大作中提到】
: 你如果用的是Qiagen 或其他公司的柱子提的RNA，那你有没有考虑过RNA样品中的洗液
: 的影响？
: 尤其是RNA浓度低的样品。因为要调成和浓度高的样品一样的总量，所以要加的比较高
: 的体积。这样在反转录体系中这个低样品的洗液就多，抑制反转录酶的活性很强。所以
: 你虽然放了一样多的总RNA，但是大多都没有被反转录。当你所qPCR时，你这个样品的
: Ct值会很高，意思就是表达很低。所以就是给你表达低的假现象。你做qPCR时，可以留
: 意一些低浓度样品的Ct值。很多人发表的qPCR的文章后来表明结果相反，有一些原因是
: 这些研究者没有考虑这个原因。
: 这是我给另外一个贴子的回复
: Qiagen柱子提取的RNA总是含很多的洗液。后面会影响到反转录酶的活性。如果每个样
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m****M
发帖数: 360 | 8 谢谢各位的回复非常感谢。谢谢TYZHET细心指点用词不当。是的应该是转染（
transfection）。
用bead提质粒太贵，操作还不方便。
刚刚定了那个qq007哥们推荐的提质粒和Gel/PCR二合一kits。和Qiagen的相比便宜很多
，将近一半。有了测试结果给大家汇报一下。 |
