m****a
发帖数: 270 | 1 对于第三点你没仔细看论文吧？
看了一下论文，作者先转Ago，然后分别在12h和24h转gDNA，fig 2b显示12h无影响，但
是24h load的gDNA明显减少。
作者的解释是NGAgo 装载gDNA可能需要在翻译折叠的阶段进行，所以如果后转染gDNA可
能导致体内已经成熟的Ago无法结合gDNA，这也解释了为什么体外纯化的Ago蛋白无法在
37C装载gDNA，而只能55C装载，代价是可能导致蛋白部分失活变成一个Nikase。
另外作者在supplemental里面也提到了可以通过再次转染gDNA的方法提高效率。
3.文章说如果同时转入Ago表达质粒和gDNA，就能行。如果先转Ago质粒，8小时候再转
gDNA，就不行。这里我无法理解。难道先转Ago质粒8小时候，这个质粒就不表达了？如
果继续表达，那8小时候再加gDNA跟同时一起转细胞又有什么区别呢？难道
transfection效率太低，以至于2次transfect的东西无法进入同一细胞，因而不行？至
少从这个角度来讲，文章的一个主要figure的结果有点奇怪。 |
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s*****i
发帖数: 315 | 2 我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
题。
质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？ |
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r********s
发帖数: 149 | 3 我也试了一次，没做出来。现在准备用他们的gata4来做positive control.
[在 samalli (小米) 的大作中提到：]
:我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
:oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
:题。
:质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
:也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？
:天下熙熙，皆为利来；天下攘攘，皆为利往。 |
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发帖数: 1 | 4 发信人: samalli (小米), 信区: Biology
标 题: Re: 闊╂槬闆ㄧ殑NgAgo鏁堢巼鎬庝箞鏍凤紵鏈変汉璇曡繃涔堬紵
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jun 4 14:56:56 2016, 美东)
我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
题。
质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？ |
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发帖数: 1 | 5 发信人: raindallas (Never give up), 信区: Biology
标 题: Re: 闊╂槬闆ㄧ殑NgAgo鏁堢巼鎬庝箞鏍凤紵鏈変汉璇曡繃涔堬紵
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jun 4 20:32:20 2016, 美东)
我也试了一次，没做出来。现在准备用他们的gata4来做positive control.
[在 samalli (小米) 的大作中提到：]
:我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
:oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
:题。
:质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
:也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？
:天下熙熙，皆为利来；天下攘攘，皆为利往。 |
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发帖数: 1 | 6 作者：剑客王
韩强调几点:
1. fig3C做不出来说明基本技能不行，往下做就更不行。而且fig3C 审稿人
在发表出来之前已经重复出来了。【审稿人来重复来稿人的实验应该是很少见的】
2. 如果质粒提的好，细胞无污染【这两个是最基本的，质粒提纯现在非常
容易，也容易检测纯度。如果细胞有污染出现不应该是这实验才会有，该细胞室
不时会有的。即使有污染换没有污染的细胞总可以的】，重复率应该是100%.
3.强调系统的不稳定性【做的出做不出靠撞大运？】，要等候2.0 版。
4. NgAgo一出，某利益公司要赔上亿，暗示有人黑他【文章都公开发表了，
东方不亮西方亮，这是一个有突破的方法，大家都会去试，几个人也黑不了的】
5. 据说韩已经把质粒卖给Addgene。朋友想从该公司中国部买，“不太顺利，
手续很复杂，有点诡异神秘，不清楚咋回事，正在努力搞到”【从这个信息看
Addgene似乎手头有这个质粒，现在风头上有顾虑，不敢轻易出手-如果收了钱，
出不来结果，麻烦事多多】
(XYS20160720) |
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W*****n
发帖数: 21 | 7 试着整理了一下.
刚开始有人在Google论坛上说阿狗切不了内源DNA,也切不了转入DNA,自己太衰了,请高
手指点一下.结果有一群人都说阿狗切不动.
突然有个印度小哥debo说阿狗神勇,一试就灵. 与阿狗共转染的GFP质粒表达GFP蛋白明
显下降, 暗示GFP质粒DNA被阿狗切段, Fig 3C 被重复. 众人一追问,debo小哥说没做
DNA实验.看似印度小哥对T7E1实验不太熟. 众人讨论GFP蛋白表达下降也许是由于其他
因素,诸如导向DNA影响转译, 或是GFP质粒DNA转染效率本身在试验组和对照组中就有差
异.也就说对照不严格, 是个假对照. 过了几天, 印度小哥debo悄悄发贴说DNA实验结果
为阴性. 阿狗没有切DNA.
与此同时,更多的人表示Fig4 无法重复. 有人说实验是在293细胞中做的, 也许在HeLa
细胞中会有不同结果. 也有人明确说在HeLa中也不行. 无任何DNA被切证据.
突然又有个澳洲老哥Gaetan Burgio发推特说阿狗神勇,在受精卵中大切内源DNA, 效率
惊人, 而且这次是DNA证据. 有图有真相. 不过老哥好象挺粗心, 图也标错了,引起... 阅读全帖 |
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z*******4
发帖数: 285 | 8 1.评判是否造假的标准。
个人认为这不是看重复/不能重复的比例。而是看有没有人能作出来，有一个人能作出
来NgAgo能切割靶点基因组DNA，就不能算是造假。
这点很多外行都不理解，认为只要大多数人没有重复出来，就是造假，这对于开创性生
物学试验而言，是不公正的评价。 举个例子，一段高CG区域的PCR，很难作出来，可能
10个学生设计10对引物，只有一个能作出来，但你能评价说PCR技术是造假？
生物学实验的影响因素太多太复杂，即便是最常见最基础最成熟的生物学实验，比如基
因克隆，蛋白纯化，质粒转染，不同的生物博士来做，有的人能作出来，有人做不出来
。哪怕同样是一个人在同一个实验室，有时候做出来有时候做不出来，这种事情只要在
生物学实验室超过3年经历，肯定会遇到/听到很多次。
所以，用“很多人都做不出来“判定造假，这是不公正的评价。
2.仇子龙重复出来了靶点DNA的切割，但不知数据如何，因为外人看不到他的数据。如
果数据可靠，证明NgAgo能切割靶点基因组DNA，这就是对韩春雨工作的认可和肯定，造
假之说应该停止，因为对科研工作者而言，这恐怕是最恶毒的攻击。
3. 韩显然是没有坦诚布公，他... 阅读全帖 |
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m****s
发帖数: 18160 | 9 2016年5月2日，英国《自然》杂志子刊《自然 生物技术》刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文，论文负责人的英文署名是"Chunyu Han"，这篇论文在华人生物界获得广泛赞誉。论文发表的第二天，韩春雨的名字和论文在一个名为"生物艺术全球生物医学交流"的微信群里得到了热烈讨论。生命体从受精卵开始，经过不断分裂，可分化出大约60兆亿个构建人类身体的细胞，每个细胞都含有全部生命遗传信息的基因组，所谓基因组编辑技术，就是人为来调整、改变、插入、去除、修改个体或物种的基因组序列。
http://tv.cctv.com/2017/05/20/VIDEBZRf7rQNg2Y1ExpBhpQM170520.shtml
一、学界和媒体的热议Mitbbs.com
一年前，英国《自然生物技术》杂志刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文。论文的负责人"一鸣惊人"，得到了学界和媒体给予的无限荣光。在《自然》杂志社的所属期刊上发表论文，通常表明，该科研成果走在了世界科学研究的最前沿，并有可能对未来科学的发展起到关键性作用。此消息一经媒体爆出，在站内引起站内相关专业人士的热议。
国内科研水平不得了了... 阅读全帖 |
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f**********r
发帖数: 18251 | 10 【 以下文字转载自 Joke 讨论区 】
发信人: biokold (kold), 信区: Joke
标 题: 转贴：《范博中Cell》， 苦逼千老写照 (转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jun 24 00:35:12 2014, 美东)
发信人: dongHei200 (医学小子), 信区: Biology
标 题: 转贴：《范博中Cell》， 苦逼千老写照
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jun 23 13:33:06 2014, 美东)
范博做完实验回office，实验室刚来的rotation student、一块搬砖的千老俱各欢喜。
正待烧锅做饭，只见他老板Dr. 胡，手里拿着一盒miniprep柱和一瓶培养基，走了进来
。范博向他作揖，坐下。Dr. 胡道：“我自倒运，把个博后位置给与你这现世宝 ，历
年以来，不知累了我多少。如今不知因我积了甚么德，带挈你中了个PLoS ONE ，我所
以带个培养基来贺你。”范博唯唯连声，叫rotation student把柱和培养基收起来，在
实验台边上坐着。Rotation student自和小本科生在细胞间换m... 阅读全帖 |
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y***i
发帖数: 11639 | 11
这就胡扯了。
转基因用的是质粒转染。有篇报道，说在胃里的细菌内发现过转基因植物的转染质粒
（或是基因）。
当然还没有证据说这些质粒转移到人身上。不过如果有这种可能，那还是挺瘆人的。
怎么说杂交都是更安全的。 |
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h******y
发帖数: 1374 | 12 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: StephenKing (88), 信区: Biology
标 题: 弱弱地请教酶切问题！！！
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Apr 29 22:03:59 2011, 美东)
我最近酶切质粒（PMD-18T)总是切的相当不好，能切开，但是切开的目的带特别弱，质
粒很亮，我guarantee质粒浓度没问题，会不会是目的带弱质粒本身的碱基数太多了？
我用的酶是ASCI和NCOI，请高手指点，不胜感激！
PS：我在考虑可不可以加大上样量，或者在酶切体系中少加点水？
PPS：我以前博士做的是bioinfo，现在博后为了跟一个NAS的大佬，被强迫做bench
work，这一年来非常痛苦。进展很慢。只有一篇文章，刚写好，压在老板手里，还没改。
我是不是应该转回bioinfo？ |
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b*****l
发帖数: 491 | 13 转载一个：
在全世界，目前种植面积最大的转基因作物，是转基因Bt玉米和棉花以及抗除草剂的转
基因玉米和大豆（美国没有种植任何转基因抗虫大豆）。其中，转基因Bt玉米所生产的
转基因Bt蛋白具有杀虫作用，并有可能直接进入食品。在目前有关转基因的争论中，吃
转基因Bt蛋白是否安全，就成了一个焦点。要回答这个问题，首先要了解Bt蛋白为什么
能抗虫，也就是说，它的毒性从何而来。
Bt是苏云金芽孢杆菌的拉丁学名Bacillus thuringiensis的缩写。苏云金芽孢杆菌是生
活在土壤中的一种细菌。在有关转基因的讨论中一般所说的Bt蛋白，特指该细菌所生产
的两类蛋白：一类是该细菌孢子（生殖细胞）内的一类通称为Cry的结晶体蛋白，另一
类是该细菌在营养生长期生产的叫做Vip3的分泌性毒蛋白。第一代Bt玉米品种只含有
Cry蛋白，而第二代Bt玉米品种则可能两类都含。
值得一提的是，Cry蛋白并不是由苏云金芽孢杆菌本身的DNA编码的，而是由该细菌所带
的一种叫做质粒的病毒性小颗粒的DNA编码的。因此，不同的苏云金芽孢杆菌株可携带
含不同Cry基因的质粒。而含Cry基因的质粒也可被其它近源细菌所携带。... 阅读全帖 |
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m*******t
发帖数: 482 | 14 算科普，但都是十年前的知识，这十多年转基因的技术发展很快，我说的一些问题应该
可以有改进了。
要获得转基因植物需要两个技术：一是植物组织培养，二是外源基因导入技术。
首先，你没法扛着注射器给老榆树疙瘩扎针吧？所以要转基因得先用激素让植物组织生
长得比较松散。对这种松散的植物组织，你可以大致理解为皮薄，外源基因容易进入。
但这种松散的组织有个大问题，就是它们还能不能重新生成完整的植物。你做半天转基
因，不能拿一堆开不了花结不了果的糟面团子去喂猪吧。所以植物组织培养中最考人的
就是所谓的植物再生。这不奇怪，世间任何事物都是破坏容易建设难，造谣容易辟谣难。
有网友说：美国只做玉米转基因不做小麦转基因，因为小麦是美国佬的主食，他们怕祸
害自己所以不做小麦转基因。但在我看来，更主要的原因恐怕还是小麦组织培养的问题
。小麦在植物组织培养领域臭名昭著。直到公元两千年后，很大程度上归功于中科院遗
传所的工作才解决了这个问题。组织培养过关后，转基因问题倒不太大。但从转基因植
物到拿到新品种就麻烦了。首先，你得拿到能够稳定遗传的植株。老子变成了鹰沟鼻子
蓝眼睛，儿子女儿还是老祖宗的塌鼻梁黑眼珠，转了等于没... 阅读全帖 |
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n**e
发帖数: 2026 | 15 川普总统的首次国会演讲得到广泛的赞许。然而，人们很快就知道，这篇演讲稿的捉刀
人是第一女儿伊万卡。尽管伊万卡为川普总统设计的包装博得一片叫好，却丝毫不能改
变这篇演讲的反理性本色。比如，911以来在美国发生的杀人事件主要是移民犯罪还是
本土犯罪？美国公司境外建厂是输出财富还是攫取财富？美国是不平等贸易的受害者还
是制造者？奥巴马医保法案是灾难还是得到多数人民的拥护？
在川普看来，全世界都在变着法欺负美国，抢劫美国。包括中国伊朗墨西哥朝鲜这些企
图搞垮美国的敌人。也包括欧洲，澳洲，加拿大，日本韩国这些整天想占美国便宜的所
谓朋友。也许只有聪明的俄国人一直在暗中帮助美国。如今的美国已经是国破山河在，
城荒草木深。而客观现实与川普的认知完全是相反的。这篇文章就单说说川普演讲中颇
为扇情的梅根父亲制药救儿的故事。引号中都是川普演讲的原文中译。
『梅根被诊断患有庞贝氏症，一种罕见的重疾，她当时只有15个月大。医生认为她活不
过5岁。得知这一噩耗后，梅根的爸爸约翰，倾尽所有去拯救自己宝贝孩子的生命。他
建立了一家公司来找寻治愈方案并协助研发了拯救梅根的药方。今天梅根已经20岁了，
在圣母大学读大学... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 16 【 以下文字转载自 Joke 讨论区 】
发信人: pokerjack (jack), 信区: Joke
标 题: Dr. Poker优秀短篇小说选
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Jan 31 23:35:46 2019, 美东)
1. 真有小姐会解几米多维奇的
12年前哥eb1a刚绿，回国。兄弟道上混的，带我去厦门的夜总会。
当时哥不太懂，选了出来时手放后面的。后来才知道手放后面不让带出去肏，放前面的
才卖身。
小姐大概8分，当时晚上唱歌，摩摩梭梭搂搂抱抱。小姐说别这样，半推半就。我才明白
小姐是陪酒赚点钱不是职业卖身的。一问小姐说道是南昌大学数学系的。家里不大有钱
，想在夜总会认识些有钱人，然后赚点外快。
我一听扯犊子呢？？！哪个小姐不自称大学生，不就是想多要点小费么？哥当时要现场
戳穿她，给她出了道几米： 1*3*5*7*....*1999等于多少。他妈的这道题我高二的时候
做过，但也记不清最后的解了。
小姐一听，说要用斯特林格公式，但是公式她不会背了，而且好几步演算也不好现场解。
哥一听愣屄了。
散场的时候给了1500人刀小费，问小姐肯不肯来一发，小姐坚决不干，说谢... 阅读全帖 |
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f****g
发帖数: 1263 | 17 请教各位大虾，那一种质粒载体用于哺乳动物转染效率比较高，比如invitrogen公司的pcDNA3.1质粒载体。
近两三年有无转染效率更高的质粒载体出现，最好是公司的上市产品。急急急！先行谢过了！ |
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f********n
发帖数: 6465 | 18 我原来制备过一次单克隆细胞系，就是同一个质粒转染挑了15个细胞系，然后RT——
PCR，免疫染色来筛选出了一个表达很好的单克隆细胞系。
这次，因为一次要制备很多突变质粒(共8个左右）的单克隆细胞系，我实在是太累了，
累到郁闷死了。所以每一个突变质粒的转染，我就通过ＲＴ－ＰＣＲ选择后，冻存了２
个细胞系左右吧。
现在麻烦来了。
用ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ没有死的细胞，ＲＴ——PCR也没有问题，可是免疫染色时，明
显的看到有一半的细胞没有荧光（也就是没有表达ＦＬＡＧ标签蛋白，也可以推断没有
表达我的目的膜蛋白）。
这样该怎么办啊？明显不是单克隆细胞系。 |
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s*****h
发帖数: 108 | 19 转到细胞双链DNA，我知道如果瞬时转染，DNA 将不能整合到基因组去，但是如何会有蛋白产生？ 非常疑惑 。
我不知道这一段DNA是如何进入细胞核的，进去了，一直处于游离状态，人家细胞自己
的DNA开始转录，可外来的DNA自己又没有promoter，怎么开始转录成RNA啊？
另外一个问题，是不是转染到细胞里，双链线性DNA，环状DNA，都可以？ 那单链DNA可以吗？
还有一个问题，我们平时摇菌，扩质粒，这些质粒都自己可以独立复制的吧，都是基本不整合到细菌基因组的吧。我们摇菌用的细菌自己有自己的质粒对不对？
分生非常差，不好意思，谢谢！ |
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x*****e
发帖数: 309 | 20 贴个我的做法吧，成功率很高，供参考。
1、引物退火溶液Annealing buffer: NaCl 100 mM, Hepes 50 mM, pH 7.4
(1ml: NaCl 2M 50ul, HEPES 1M 50ul, 加水至1 ml，pH试纸调pH)
2、引物浓度约=28.3ug/OD, 加入94ul Annealing Buffer 至终浓度 0.3 mg/ml
3、加入上下游引物各10 ul，Annealing Buffer 30 ul，90度4分钟，70度10分钟，然
后放到500 ml装有70度热水的烧杯中，室温冷却后连接或-20度保存。
4、连接质粒，加入2ul退火后的产物，1 ul T4 DNA ligase buffer, 1ul pSR/BglII+
HindIII 线性质粒, 5 ul 水，1 ul T4 Ligase. 连接（16度过夜或室温30－120分钟）。
5、加入1 ul Bgl II 至连接产物中，37度消化30分钟，转化感受态细胞。
6、挑取转换子，提质粒，酶切鉴定，注意阴性克隆切出条带大概1kb（227，248和
281bp条带差异不明显，故对 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 21 DNA quality和你用的antibiotics没什么必然联系吧。Chloramphenicol用酒精溶没什
么错。
你的质粒是怎么提的？DNA quality不是光看OD就行了啊。你做过限制酶切然后跑胶看
么？你送去测序的质粒浓度是多少？太浓或者太稀都可能测不好，质粒测序的模板用量
在200-500ng之间结果最好。 |
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d**********t
发帖数: 20415 | 22 把整个质粒测一边序，从别人那里要过来的质粒出什么问题都有可能
另外看看引物有没有问题，别犯什么低级错误，比如用的引物一个方向什么...能找个
其他质粒作positive control的话最好
异的PCR问题，
何trouble
)。这个
；可是做下
（当然如果模
，还是一
疑这个 |
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h**********d
发帖数: 30 | 23 基本情况：
E.coli C43, cyoABCDE knockout(Km)表达cytochrome bo3, tyrA knockout(Cm)
tyrosine生物
合成中的一个酶（从prehenate到4-hydroxy-phenylpyruvate)
pAc-YNH2 plasmid(Tet): proK promoter + 6 copy of M.j tyrosine tRNA, glnS
promoter
+ 3-aminno-tyrosine M.j tRNA synthase (M.j is an archea strain)
pET plasmid(Amp): T7 cyoABCDE w/ cyoB Y288Amber stop codon mutation
要表达的是cytochrome bo3 mutant protein, 在蛋白里genetically引入一个非天然氨
基酸
（peter schultz组的技术，pAc-YNH2质粒也是从他们组拿给MIT的STUBBE组做的，她们
组没遇
到过这个质粒的问题）
这两个质粒同时存在于E.coli c43里的时 |
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h**********d
发帖数: 30 | 24 funtional,但是当然是比WT还原氧气的活性要低，每次得到蛋白，我会从光谱看SORET+
ALPHA
BAND，用PAGE看4个亚基，用HPLC测醌和HEME的比例，最后ICP-OES表征一遍蛋白的铜和
铁含量，
应该都是正常FOLDING的蛋白，CW-EPR,RAMAN光谱的数据也都会告诉我蛋白是否正常。
烦请前辈能告知一下PET质粒的浓度在MINI PREP后多少为宜呢？比如5ML的OVERNITE
CULTURE，按
照我的经历，这个双质粒体系两个在一起如果用50微升洗脱，质粒总浓度在50到100ng/
uL之间，
而且每次PET都比PAC的条带看起来更亮一些。
多谢了
luck |
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h**********r
发帖数: 671 | 25 难易程度因细菌而异，有的菌你敲两三个基因就发PNAS,有的你挨个儿敲1000个基因也
许可以发PNAS。
敲除可以用mob型的自杀质粒或者类似于Tn5转座的质粒。DNA导入可以电转也可以二亲
（三亲）结合转导。具体情况具体分析。
还有的可以double crossover把marker切掉，利于下一轮的敲除。
你可以看下这篇paper,Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived
from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined
deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum.
Gene, 145 (1994) 69-73.
质粒pK18mobsacB在G+,G-细菌用的都很广泛，全序列已知。可以从ATCC买到。
house keeping gene不知道，看是不是条件致死啥的或者营养缺陷型。又不知道你说的
是啥细菌。 |
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C******r
发帖数: 790 | 26 克隆质粒没那么简单吧
说说我碰到的问题：
要把0.5k，2k和4k的3个片段依次插入一个载体质粒
3个片段都是PCR产物
0.5k的两端用A酶切序列引物，很顺利通过酶切——连接进去了
然后PCR的到2k的片段，两端引物用的是B酶切序列
1、B酶切质粒载体和PCR片段，直接连接，长的菌落做酶切，重复了几次，筛了可能上
百个，都不是
2、试图把2k的PCR片段先连到TopoTA vector里，诡异的是，即使白斑做筛选，仍然是
垃圾菌落，没有想要的片段
以上2种方案换个人做，也没做出来
与此同时，4k的PCR产物往TopoTA里面连，一次就连成了。说明TopoTA的kit并没有问题
。试了不同公司的2k片段的primers，都是能PCR出一条2k的很干净的条带，但是竟然连
TA vector都进不去。
不得不感叹：真是见鬼了。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 27 最好两端不用同一个酶，
克隆质粒没那么简单吧
说说我碰到的问题：
要把0.5k，2k和4k的3个片段依次插入一个载体质粒
3个片段都是PCR产物
0.5k的两端用A酶切序列引物，很顺利通过酶切——连接进去了
然后PCR的到2k的片段，两端引物用的是B酶切序列
1、B酶切质粒载体和PCR片段，直接连接，长的菌落做酶切，重复了几次，筛了可能上
百个，都不是
2、试图把2k的PCR片段先连到TopoTA vector里，诡异的是，即使白斑做筛选，仍然是
垃圾菌落，没有想要的片段
以上2种方案换个人做，也没做出来
与此同时，4k的PCR产物往TopoTA里面连，一次就连成了。说明TopoTA的kit并没有问题
。试了不同公司的2k片段的primers，都是能PCR出一条2k的很干净的条带，但是竟然连
TA vector都进不去。
不得不感叹：真是见鬼了。 |
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b*******6
发帖数: 39 | 28 实验的目地是表达和纯化一个蛋白，加入不同的Translocation mitif，使它能够加到
培养基里面能够进入细胞内。
对于下面实验:
1 换引物、突变回去估计不太现实
2 因为出问题总是在Bamh1-Bgl2位点，而载体因为考虑Bamh1星号活性的问题只切了1小
时，所以考虑过夜切；还有考虑毒性问题，降低培养温度。质粒切以后跑胶的时候有一
个问题就是跑得不是很平直，不知道是因为我没有切好还是质粒量太多。
3 请别人做不是没考虑过，但是负责我的那位高年级博士生估计PCR都有问题，因为他
也做过，但是没做下去。长引物容易形成二聚体，我是用Touchdown PCR或者里面加了
甘油才解决问题的。
4 插入的片段很普通，就是600bp左右，关键是要加的tag，3个不同tag，是
translocation motif，加在蛋白上面用于进到细胞里面去的:
TLM 1 (PLSSIFSRIGDP, 12 aa)
CCGCTGAGCAGCATTTTTAGCCGCATTGGCGATCCG
TLM TAT (GRKKRRQRRRPPQ, 13 aa)
GGCAGGAAGAAGCGGAGACAGC... 阅读全帖 |
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c****1
发帖数: 1095 | 29 DNA marker不是很便宜，实验室用量很大（小分子量的），老板不肯花钱买，让我们自
己做。老板
提的方法是，用PCR，扩不同大小的产物，然后混在一起。我觉得，自己改装一个质粒
，然后用一个
单一的酶来切，得到不同大小的片段。质粒容易量产，酶切也容易，我想那些公司应该
用的就是这个
办法。不知到哪里可以买到这样已经改装好的质粒。有没有哪位同仁愿意share？ |
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S*********g
发帖数: 24893 | 30 我最近酶切质粒（PMD-18T)总是切的相当不好，能切开，但是切开的目的带特别弱，质
粒很亮，我guarantee质粒浓度没问题，会不会是目的带弱质粒本身的碱基数太多了？
我用的酶是ASCI和NCOI，请高手指点，不胜感激！
PS：我在考虑可不可以加大上样量，或者在酶切体系中少加点水？
PPS：我以前博士做的是bioinfo，现在博后为了跟一个NAS的大佬，被强迫做bench
work，这一年来非常痛苦。进展很慢。只有一篇文章，刚写好，压在老板手里，还没改。
我是不是应该转回bioinfo？ |
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j****x
发帖数: 1704 | 31 如果质粒不特别大的话，感觉比较简单的策略就是NEB的突变策略。
在想删除的位点两侧设计“背靠背”引物（必须5'端磷酸化修饰），把你需要替换的序
列设计在引物上。扩增整个质粒，PCR产物就是线性化的目的质粒序列，然后self-
ligation即可。
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d*******s
发帖数: 61 | 32 我觉得maxi提出来的质粒有时候转染效率很低，可是ratio 260/280在正常范围内。或
许是什么没检测出的东西污染。 所以现在一直用mini提出来的质粒做转染，结果不同
质粒的表达水平——那叫一个均一啊！ 就像actin 一样的 |
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S*****s
发帖数: 287 | 33 如果 GFP 和 质粒一起做 cotransfection 的话很可能会遇到这样的问题，在难转染的
细胞上差别更明显。如果你把 GFP 和你的要表达的基因克隆到同一个质粒上应该就不
会有这个问题。我用 BAC 可以连另一个单独表达 GFP 的质粒，如果你要表达的基因比
较小，可以考虑用 IRES GFP。我们隔壁实验室用 Clontech 的 pLVX-IRES-ZsGreen1
克隆基因然后转 Neuron，效果也很不错。荧光强度比较高，而且每一个带 GFP 的
neuron 都能有基因表达，在电生理上能看到区别。 |
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W*****o
发帖数: 1780 | 34 某牛人，每天朝九晚五，周末不加班，但文章很多，档次也不错。终于明白人家怎么做
实验的了。
老板和另一大牛合作，克隆新基因，表达纯化蛋白，对方做功能。课题交给该牛人。
牛人上网搜了一下。不去定引物，不去杀老鼠提RNA，直接从公司A定了含该基因的质粒
。第二天收到。纯化测序正确。质粒邮寄公司B.告诉对方用什么细胞表达，要多少纯化
的蛋白，不能有标记什么的。两个月后收到纯化的蛋白和详细实验报告（包括质粒构建
，western，纯化等等）。纯化的蛋白送到学校测试中心C质谱测了一下纯度，浓度，确
定序列正确，寄给合作单位D。两个月之后收到活性试验结果和报告。该牛人写了摘要
和introduction，把公司的结果和合作的结果合在一起。老板修改投稿接收发表。从合
作到文章出来差不多半年。老板和合作方对其赞不绝口。 |
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L*******m
发帖数: 41 | 36 neon好像是对质粒浓度有要求，1ug/ul？最后质粒体积不能超过总体积的1/10还是多少
，miniprep达不到这个要求。而且neon用的质粒不推荐乙醇沉淀。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 37 最近开始自己包装慢病毒shRNA，用的是之前组里师姐的protocol，基本上是基于TRONO
LAB的protocol。之前师姐包装的病毒，效率很高，基本上能KD八成到九成。最近我自
己包装了两次，浓缩后根据之前师姐包装的病毒用量感染肝癌细胞，细胞生长速度明显
延缓，形态改变也跟之前的相似。但是做western却只能看到很marginal的蛋白水平降
低，在有的细胞株甚至完全看不到KD。我用GFP质粒转染HEK293FT，效率很高，24小时
至少看到90%的细胞有GFP表达，然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞，24小时候也
能看到至少80%的细胞表达GFP，说明包装过程中所用的包装质粒，试剂以及细胞应该没
有问题。我现在有两个疑问，请有经验的战友指点：
1）师姐留给我的protocol上，转染HEK293FT的方法如下，以10cmdish为例：
prepare the following transfection mix:
10.0 ug GFP(or other gene of interest)
10.5 ug pLP1
10.5 ug pL... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 38 厚着脸皮来问一下，需要做cloning在一个质粒里同时表达四个基因，
以前知道有些iPS 的质粒可以做这个事情，请问大家知不知道那个质粒
叫什么名字？ |
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M****5
发帖数: 36 | 39 在原来的实验室干活的时候做了很多菌株（knockouts和一些genomic modifications）
以及质粒，比较大的一部分都是没有发表的，如果离开了实验室，以后有新人接手课题
用到我做的但是没有发表过的这些菌株和质粒，能否和原老板谈让他把我的名字放到文
章里呢？这个要求是合理吗？如果是发表过的菌株和质粒呢？是不是就不太合理了？
是自己走之前做出的数据（摸索了比较长得时间，而且先前的各种样品，比如蛋白，质
粒，荧光标记的探针，菌株等），如果老板让新人重复了，那么这些重复性的数据我有
没有credits呢？还是都属于新的学生了？
自己之前花了很多时间教了新的学生做实验，如果这个新的学生发了文章，我的名字会
在上面吗？
不好意思，问题比较琐碎。即将毕业了，蛮希望找个机会和老板谈谈，因为过去工作也
比较努力，做了不少摸索的工作，有不少是没有时间能在走之前完成和发表的了。但是
不是很确定哪些工作是可以在文章有名字，哪些是不可以的。鉴于实验室前人的和自己
的各种经历，觉得自己还是得问问确定老板的想法并且让老板知道自己的想法才行,不
然的话，以前的工作都是白做了。。。先谢谢大家的指导了！ |
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h***9
发帖数: 662 | 40 先谢谢大家的答复。
报告一下进展。我后来用Not1-HF切了，杂带还是在。未切的质粒里也有同样的杂带，
证明不是酶切的问题。试了老早以前做的另一个maxi prep的质粒，同样用Not1-HF切，
那个却很干净，没有杂带。
另外，差不多同时做的mini prep的这个出问题的maxi prep质粒，也出现同样的杂带。证明不是maxi prep kit的问题。
我现在怀疑是competent cell的问题了，因为老早以前用的是公司买的，最近用的是同事做
的。准备弄点公司买来的cell,重做maxi prep. |
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i*****i
发帖数: 154 | 41 二代和三代的差别，在packaging system上，由二代的Gag/pol/Rev + VSVG，变成了
Gag/pol+Rev+VSVG，两质粒变成三质粒。病毒的编码区的进一步分割，分离，可以降低
重组野生病毒（有自主复制和感染能力）的可能性。
比较典型的二代是pspax2+pMD2.G 以及pcmv dvpr 8.2+pCMV VSVG。
而比较典型的三代是pMDLg/pRRE+pRSV-Rev+pMD2.G, 以及Invitrogen的包装系统，都是
三代。
其实clontech的包装系统应该是第四代了，虽然这个系统采用了旧的驱动系统，但是对
整个病毒蛋白的编码区做了进一步的split，并引入了tet调控，所以，应该是更安全一
些。但是共转染7个质粒的效率，显然不如三个。所以，第二代系统仍然是titer最高的
最有效的系统。 |
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a*****x
发帖数: 901 | 42 piggybac是随机插入。克隆到piggybac质粒应该不难，就是酶切再连接。难道你已有的
质粒没有多克隆位点了？helper质粒你应该可以问那个发文章的实验室要到。
在 sunnyday (飞鱼) 的大作中提到: 】 |
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l******g
发帖数: 1145 | 43 50aa的tag的话，直接挂引物上有点太大了，我没有试过。
你要加的tag如果已经在其他质粒里的话，要么直接切，要么pcr带酶切位点扩增出来后
，先subcloning到lentivirus的表达载体里，一事两便，靠近5’和3’的msc各做一个
。5’的那个记得要有start codon。这两个质粒，以后可以用来放其他要tag的蛋白。
在克隆好带tag的lentivirus质粒后，再用pcr带酶切位点扩增你的目标蛋白，然后
subcloning进去。
注意：
1.在5’加tag的话，如果有现成酶切位点可以利用的话，可以直接subclone，不用pcr
的话，可以减少mutation的几率。
2. 3’加tag，扩增目标蛋白时，记得把stop codon去掉。
3.设计流程时，千万注意最后蛋白和tag是in frame的（连在后面的那个）！！ |
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z*******o
发帖数: 1794 | 44 类似的现象我碰到过一次，原因是：楼主的菌不是单克隆，所以你提出来的质粒也混了
其他的无关质粒。如果是这种情况，可以挑菌划板，挑两个单克隆提质粒看看是否还有
这种现象。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 45 呵呵，我想如果你真看了这篇paper，你就不会这么说了
这里面的质粒和试剂，都是最简单最基本的，这个gene如果你扩增并插入一个表达载体
，花费不会超过3天，得到一个简单的稳转细胞系，估计也就是2周左右的时间。
事实上这就是这篇文章的价值所在，不需要特殊的试剂和质粒，不需要特殊的技巧和秘
方，你就可以像建立一个简单的HBV体外感染模型，解决了这个领域里的一个根本性难
题。
倒是当年Bartenschlager建立HCV体外复制系统的时候，确实是你说的这样，几乎全世
界的研究小组都来要质粒和细胞系，直至今日，他还仍然专门雇着一个tech来处理这类
事务。
所谓“发贺电”更可能是交流结果和询问进展。但是前面总得说点好听的话，这个中国
式的表达，我觉得没啥问题，也没看出啥J点来，说实话
send
please |
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j****x
发帖数: 1704 | 46 如果假定每个transfection reagent-plasmid complex单元中两个质粒的比例是一定的
（这个前提并不难推断），那么进入单个细胞中的两个质粒的比例也就是一定的。
至于用报告质粒共转染作normalization，一定程度上也是基于了这个前提。如果两者
进入细胞不成比例的话，用这个方法来消除转染效率的不同就没有多少意义了。
be
irrelev |
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a*******a
发帖数: 4233 | 47 转这么大的质粒没问题
但是如果要表达的基因ORF太大可能会有问题。。
我转染15k的质粒，表达一个长度为5.5k的基因经常能转进去但是不能表达
同样的15k大小的质粒，包含 4k的基因+1.5k的ires-gfp就没有问题。。 |
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P*******1
发帖数: 169 | 48 "训练猴子纯化质粒，养老鼠等等"
问题是猴子不知道何时该提质粒， 提多少？ 提完后干吗？ 没有几个实验室可以有那
么多质粒供同一猴子常年累月的提。 同理， 按你的逻辑， CS 就是敲键盘。 猴子也
能敲键盘，我家有个猫都能敲键盘， 别说猴子了。问题是猴子不知道敲哪个键盘， 敲
几次？ 敲完后干吗？ |
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P*******1
发帖数: 169 | 49 "训练猴子纯化质粒，养老鼠等等"
问题是猴子不知道何时该提质粒， 提多少？ 提完后干吗？ 没有几个实验室可以有那
么多质粒供同一猴子常年累月的提。 同理， 按你的逻辑， CS 就是敲键盘。 猴子也
能敲键盘，我家有个猫都能敲键盘， 别说猴子了。问题是猴子不知道敲哪个键盘， 敲
几次？ 敲完后干吗？ |
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H*******i
发帖数: 196 | 50 10K多的质粒有时候修改操作起来麻烦点？有的实验室用惯了可能也就习惯了，因为他
们的操作都在另外两个工作质粒上，每次只需要把基因修改在工作质粒上，然后连成这
个载体就行了。。
看图谱EcoRI在HygroR那个位置，只要换个同义突变就行了 |
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