h**********r
发帖数: 671 | 1 最近在想构建一个整合型质粒,怎么也想不明白.都说是整个质粒线性化以后会整合到宿
主菌中的基因组中.可我老觉得很容易二次重组把整合的片段弄丢了.把图附上,大家给
看看我哪儿想得不对.
非常感谢! |
k********u
发帖数: 2209 | 2 看你的实验设计。如果只是想把质粒整合到基因组里面，一次cross-over，
质粒是插进基因组的。你的示意图，第二步，酶切后的质粒依然呈环状，
与宿主菌上的同源序列配对，然后cross-over。
【在 h**********r 的大作中提到】
: 最近在想构建一个整合型质粒,怎么也想不明白.都说是整个质粒线性化以后会整合到宿
: 主菌中的基因组中.可我老觉得很容易二次重组把整合的片段弄丢了.把图附上,大家给
: 看看我哪儿想得不对.
: 非常感谢!
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h**********r
发帖数: 671 | 3 多谢楼上！
我只是想做整合，不是敲除。
下面这个图 靠谱不？
多谢！
【在 h**********r 的大作中提到】
: 最近在想构建一个整合型质粒,怎么也想不明白.都说是整个质粒线性化以后会整合到宿
: 主菌中的基因组中.可我老觉得很容易二次重组把整合的片段弄丢了.把图附上,大家给
: 看看我哪儿想得不对.
: 非常感谢!
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k********u
发帖数: 2209 | 4 closer, but not exactly.
我在网上找到的，
http://www.molecularinfo.com/MTM/K/K4/K4-1.pdf
第19，20页，（页码7，8），单次重组，插入整合；
第22页，（页码10），两次重组，替换/敲除。
那个图有一个缺点，就是没标环状的质粒，其实是切开的，这个要记住。
【在 h**********r 的大作中提到】
: 多谢楼上！
: 我只是想做整合，不是敲除。
: 下面这个图 靠谱不？
: 多谢！
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h**********r
发帖数: 671 | |
q*****d
发帖数: 445 | 6 我来回答你：以缺失基因的ORF为例
Chromosome: Promoter ORF Terminator
Plamsid: (Enzyme A) Promoter marker Termintator (Enzyme B)
你的质粒应该是这个上面的第二个结构，用A,B酶切之后，转化就OK了，你设计的结构
是很容易发现回复突变的，但是可以用Marker进行筛选。 |
X***n
发帖数: 366 | 7 这个E. coli也能用么？还是只能用于eukaryote?
【在 q*****d 的大作中提到】
: 我来回答你：以缺失基因的ORF为例
: Chromosome: Promoter ORF Terminator
: Plamsid: (Enzyme A) Promoter marker Termintator (Enzyme B)
: 你的质粒应该是这个上面的第二个结构，用A,B酶切之后，转化就OK了，你设计的结构
: 是很容易发现回复突变的，但是可以用Marker进行筛选。
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q*****d
发帖数: 445 | 8 我觉得原理是一样的吧，我没有做过E.coli的knock-out，酵母是这么做的。
【在 X***n 的大作中提到】
: 这个E. coli也能用么？还是只能用于eukaryote?
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h**********r
发帖数: 671 | 9 多谢!我是做表达用的,目前是想整合到rDNA序列中.
大肠中的就比较多了,你可以看看pk18mobsacB之类的.ATCC就有~~ |
h**********r
发帖数: 671 | 10 还有一个疑问,如果我筛选到了之发生一次crossover的转化子之后.这种细胞在传代之
后稳定否?会不会自己发生丢失呢? |
