m******5
发帖数: 1383 | 1 for knock in/ knock out mouse
大家一般用哪种方法纯化linealized 质粒 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 3 容易弄的小片断都被人研究过了。
这剩下这种怪异的大片段了。
惨啊。
Ecoli都很惨，本来天生的质粒没这么大的，现在非得吃进去这么大一块DNA. |
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C*******e
发帖数: 4348 | 4 我那个倒不是大质粒
就3.7kb的片段
但是很难P，也难测序 |
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n*****e
发帖数: 119 | 5 我的质粒23kb，qiagen小提大提都没有问题。但是xl-10gold细胞在我这不行，我用的
是stratagene的sure cell。
S1 |
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l*********1
发帖数: 351 | 6 用pgex－4t－1表达gst－tagged 融合蛋白。pgex是amp抗性的，现在想把amp改成
kanamycin抗性的质粒。
是不是只需要剔除抗amp的TEM基因的orf片段，换成pet体系中的相关基因，保持原有
promoter即可？
谢谢 |
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w***y
发帖数: 493 | 7 基因大概有2.6KB, PCR克隆后链接到质粒里然后转到E.coli里面扩增，做小抽然后把质
粒送去测序发现基因的两端都连进去了但是中间部分丢失。测序过几次丢失的部分好像
没什么规律，有时2kb,有时800bp。 PCR的产物还没有测序，因为看size是正确的。请
问这种情况是怎么回事？是不是菌种的问题呢？这个基因是zebrafish的基因。谢谢 |
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d***y
发帖数: 8536 | 8 你质粒有没有酶切，然后跑胶，看看目标片断有没有缺失？ |
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w***y
发帖数: 493 | 9 谢谢回复, 我曾经尝试酶切这个质粒再跑胶, 发现目标片段的长度确实跟测序的结果一
样. 中间的部分丢掉了 |
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r***e
发帖数: 2539 | 10 这种情况遇到过，降到温度可能有效。
好像质粒自己重组了。 |
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w******n
发帖数: 767 | 11 买过一个addgene的质粒，小提提不出来，大提才行。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 12 多谢楼上各位分享经验。看到有人建议用miniprep，可是我要用这个质粒做转染，
miniprep的产物可以直接转染吗？
另外，降低温度可能有效，这个温度有没有具体的范围呢？室温？30度？我昨天晚上又挑了一个放在室温下摇过夜，今早来看发现培养液清亮，应该是没涨起来，刚才又把温度加到30度了，不知道行不行。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 13 经典方法是直接摇1L，长到对数期的时候加点氯霉素抑制细胞分裂，
然后过夜。这样菌体可能和200ml的普通生长差不多，适合中大提，但
是质粒会累积很多
又挑了一个放在室温下摇过夜，今早来看发现培养液清亮，应该是没涨起来，刚才又把
温度加到30度了，不知道行不行。 |
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W****C
发帖数: 1937 | 14 很久没做原核了， 谁推荐个质粒吧， ｅｃｏｌｉ里表达一个２００个ＡＡ的病毒蛋
白， 之后要纯化蛋白。 需要表达效率高， 容易筛选， 可调控。 |
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j****i
发帖数: 6 | 15 如果那位学者可以提供下列生物试剂材料，请和我们联系
1）杂交瘤细胞
2）MAMMALIAN细胞表达质粒（可用于建立Stable cell lines)
3）Adenovirues OR Lentiviral constructs
4) Any other useful cell based assays
谢谢！
Andrew
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S******e
发帖数: 393 | 16 cDNA加载体约20kb, 转染Hela, 293, U2OS, 我试了lipfectamine2000, 效率很低，表
达及其微弱，请问有人转过大质粒吗? 除了电转外有好的方法吗？ 多谢！ |
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Q*****n
发帖数: 4546 | 17 想纯化一些tRNA，看到的文献里用的都不是我们平常用的pET或类似的质粒，不知道
tRNA的克隆跟蛋白基因的克隆是不是不大一样，请有经验的说几句 |
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h**********r
发帖数: 671 | 18 这个真不知道。不过BL21(DE)3的rossetta系列都有额外的tRNA,在一个p15 ori的低拷
贝质粒里，名字一般为pRARE或者pRARE2. |
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S******e
发帖数: 393 | 19 好懒，这么小的质粒很好提
要买的话，不少公司可以帮你提，可以去问问。 |
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T*****n
发帖数: 274 | 20 简单啊，克隆进去不就行了。在那段丢失序列附近找特异性酶切位点，PCR克隆。
不想做酶切连接的话overlapping PCR应该也行，视质粒大小。 |
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S******e
发帖数: 393 | 21 你说的浓度低的都是插入的大片段质粒吧，
如果是，那就算常见，我常碰到。 |
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h***e
发帖数: 146 | 22 没问题的
我们用过pBR322和oriV的ori在一个质粒上
work的很好 |
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f**u
发帖数: 346 | 23 我记得好象细菌染色体上是不能有两个origin的，
很奇怪为什么质粒就没问题，有人知道为什么吗？ |
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e***o
发帖数: 344 | 25 问个很土的问题，转染时，带有一种ori的质粒只会有一个copy在一个细菌里。也就是
plasmid incompatibility。google了一下，好象没有得到很专业的回答。大家有清楚
这个的吗？ 谢谢！ |
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h*1
发帖数: 64 | 26 以前也遇到过类似的情况 ，总是看到菌也很厚重就是没有质粒
后来发现原因是葡萄球菌的感染， 楼主可以检测一下。看看是怎么回事。
要是你的感受态细胞就有问题，那么你后续的所有的实验都会有问题。 |
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l****d
发帖数: 251 | 27 1 培养基污染
2 抗生素失效
3 培养时间过长
4 连接有问题，有菌落无质粒，挑菌落做个快速检测，看看有无insert
5 insert稍大，可手提看看 |
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r*****t
发帖数: 4793 | 28 我前几天试了只摇8个小时左右
菌也长，但是看起来还是不太对，离心后用枪头去吸残余的培养基的时候，会很容易吸
起细菌的pellet，就像我说的，细菌看来比较“粘”我会看看有没有质粒这次。估计够
呛。 |
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z*******o
发帖数: 1794 | 29 看看你的模板质粒是不是也是这个突变了，见过好几次，更本不是PCR的问题。
如果懒得重新连接，做回复突变吧，貌似不是很大。 |
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q*****d
发帖数: 445 | 31 看过他的方法，只是这么大的质粒不知道怎么给转到yeast里面去。 |
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q*****d
发帖数: 445 | 32 看过他的方法，只是这么大的质粒不知道怎么给转到yeast里面去。 |
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e***o
发帖数: 344 | 33 各位大虾不知是否知道怎样使转到in vivo 的质粒/基因的copy number增加。最好是使
单copy的增加到上百个。在HEK293T cell line 里的sv40可以使 copy number 增加。
不知道可不可以把这套系统用到在神经系统里。什么方法转基因都可以。virus
infection, in utero-electroporation等等。
谢谢！ |
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L*******y
发帖数: 31 | 34 请教达人，有没有什么比较好的方法可以画克隆策略图，主要费时的是质粒载体图，试
过用软件但是只能存成一张图片和其他的策略图衔接的不好，而且整体效果好像也不太
美观，不知道有没有什么方法可以做到很漂亮，清晰的。
谢谢 |
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Z******5
发帖数: 435 | 35 word 做质粒图全过程：
1，先按住Shift画一个圆弧（注意是圆弧，不是圆）
2，按住shift将圆弧拉成有缺口的圆
3，复制有缺口的圆
4，选中一个有缺口的圆，并改变颜色、线宽、有无箭头。移到另一个圆弧上，与之重
合，调整长短。
5，重复3,4，画多个原件
6，用图文框加标注、酶切位点等。
要点：
1，要用圆弧，不要用圆。
2，要按住Shift，防止变形
3，图做好后，选择所有原件，group化。 |
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e**r
发帖数: 1144 | 36 有些质粒小提的试剂盒
中和后形成的沉淀是一团，很容易离心下来，上清里几乎没有渣滓
而自己配溶液总或者某些其他试剂盒，中和后会有一些渣滓漂在上清里
什么东西能起到这种帮助沉淀的效果？ |
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h**********r
发帖数: 671 | 37 酵母做的少，e. coli做得多点。所以就有问题了。用的基本上是商业化的质粒，pESC-
leu.
问题是看不出来翻译起始位点ATG，而且多种版本的manual上面不提这个问题.不像E.
coli的pET系列,要么在NdeI要么在NcoI.
我是不是把带有ATG的ORF放在多克隆位点就行了？我亚克隆的片段自己有终止密码子，
在此之前也有tag,所以不需要载体的tag。而且载体的tag正好在C端。当然转录方向还
是要看的。
包子伺候！
多谢啊！ |
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s******s
发帖数: 13035 | 39 你得细胞转普通质粒啥的好转么？有的细胞难搞
我一般也就转转fibroblast, 还是很容易的 |
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s******s
发帖数: 13035 | 41 你得细胞转普通质粒啥的好转么？有的细胞难搞
我一般也就转转fibroblast, 还是很容易的 |
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t*****P
发帖数: 36 | 42 原来师兄用过的质粒，我拿出来重新mini extract后，转HEK293都不表达了。
把分子片段酶切下来，重新连接也还是不行。
请教怎么回事？谢谢大家！祝大家新年快乐！ |
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t******y
发帖数: 716 | 43 实验中需要用到把原代细胞永生化。不知道有哪位朋友能够提供永生化效率比较高的质
粒或lentivirus。
还有一个问题：永生化质粒表达的蛋白，有些是肿瘤基因，有些是端粒酶，有的是表达
细胞周期的蛋白。有谁知道这些不同的蛋白表达对细胞有何影响。譬如，如果我需要原
代细胞保持分化潜力，希望基因组能够保持稳定，不形成染色体变异，应该选择哪些质
粒？
谢谢 |
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g***j
发帖数: 40861 | 44 昨天接种的时候忘记加抗生素了，质粒提还是不提啊 |
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g***j
发帖数: 40861 | 45 如果等会儿有时间就提一下，不过以前没提过这个质粒，所以产率没法儿比较
those
waste |
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j******n
发帖数: 941 | 46
this
/l
E.
you
谢谢你的建议 确实kan的浓度非常影响这个质粒 我曾经用50ug/ml 一个克隆也出不来
后来按protocol降到25 就能出来十多个了我回头试试低温过夜看看 |
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c****d
发帖数: 501 | 47 谢谢了
不过第二点 是不是和我重新做这个质粒差不多麻烦了 |
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c****d
发帖数: 501 | 48 多谢！
刚刚送了剩下的几个clone去测序 但愿有个好的
但是原始的template应该没问题 那个质粒是测过序的
somehow应该就是pcr过程中mutate了
我分子生物学做的不是很多 不知道reverse PCR是咋个意思
这个plasmid有10k以上 算是大的吗？
site mutegenesis 一般自己能做吗 还是送出去公司做呢
having |
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l******g
发帖数: 1145 | 49 这个mutation的上下游有酶切位点吗？如果有的话，从原来质粒里直接切了替换过去。
site mutagenesis也是个办法，但毕竟也是pcr，不排除mutation的可能，而且连
vector的部分也要sequence。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 50 试着求一个带luxAB基因的质粒吧，关键是能快点给我就好了，要在e. coli中好用就行。
包邮啊！多谢！
当然给包子！
周末happy! |
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