s******a
发帖数: 472 | |
s******s
发帖数: 13035 | 2 以前ms讨论过。我们用lipofectamin ltx
【在 s******a 的大作中提到】
: 有没有同志有经验？
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s*********t
发帖数: 600 | |
s******a
发帖数: 472 | 4 谢谢两位
我决定先试试lipofectamine 2000
(实验室刚好有）
【在 s*********t 的大作中提到】
: 不难的，跟转普通质粒差不多。
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1199.html
: Lipofectamine 2000都可以的
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/extref/nmeth.1199-S1.
: 详细的protocol，照着做就行了。
|
s******s
发帖数: 13035 | 5 ，其实效率不重要，反正最后你多半挑克隆，有那么几个就行了
【在 s******a 的大作中提到】
: 谢谢两位
: 我决定先试试lipofectamine 2000
: (实验室刚好有）
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s******a
发帖数: 472 | 6 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
所以现在唯一能确定的是转BAC DNA（我的约250kb）还是比普通质粒要难很多的。目前
对于lipo2000也已经没有idea了。
我现在开始尝试电转，第一次参数不合适细胞全死了，接下去准备降低电压和电容再试
试。
做过BAC转染的能否指点一下呢？
题外话：
实验室另一PhD,之前用lipo转过BAC，一开始口口声声他的protocol工作（同样的细胞
），不让我优化，我最后实在转不出来才开始优化。后来，我得知他所谓work就是8-
well nunc一个well中有5个阳性细胞（转染后48小时，这时候细胞已经很密）。就这他
还高高上上的教育我，有1个细胞就可以了。
【在 s*********t 的大作中提到】
: 不难的，跟转普通质粒差不多。
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1199.html
: Lipofectamine 2000都可以的
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/extref/nmeth.1199-S1.
: 详细的protocol，照着做就行了。
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s******s
发帖数: 13035 | 7 确实有一个细胞转上就行了。效率低是肯定的
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
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s******a
发帖数: 472 | 8 问题是现在一个细胞也转不上:(
【在 s******s 的大作中提到】
: 确实有一个细胞转上就行了。效率低是肯定的
:
: 350
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s******s
发帖数: 13035 | 9 你得细胞转普通质粒啥的好转么？有的细胞难搞
我一般也就转转fibroblast, 还是很容易的
【在 s******a 的大作中提到】
: 问题是现在一个细胞也转不上:(
|
s******a
发帖数: 472 | 10 非常好，80-90%，你没有仔细读我上面的帖子啊。
【在 s******s 的大作中提到】
: 你得细胞转普通质粒啥的好转么？有的细胞难搞
: 我一般也就转转fibroblast, 还是很容易的
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l***y
发帖数: 638 | 11 1% efficiency is good enough, my cells can't even get 1%.
I have tried both electroporation and nucleofection for BAC, both work fine.
nucleofection is better and easier because reagents and parameters are
already optimized with the commerial kit.
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
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s******a
发帖数: 472 | 12 Thanks! I would have a try on nucleofection.
fine.
【在 l***y 的大作中提到】
: 1% efficiency is good enough, my cells can't even get 1%.
: I have tried both electroporation and nucleofection for BAC, both work fine.
: nucleofection is better and easier because reagents and parameters are
: already optimized with the commerial kit.
:
: 350
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h******y
发帖数: 351 | 13 我建议你尝试几种不同的转染试剂，这比尝试DNA和lipofectamine的不同比例效率要高
。特定的转染试剂有时候在你的细胞株中就是不WORK，你怎么试也得不到好的效果。转
染中，DNA的量对结果影响最小，如果你用100ng的BAC DNA，即使是300Kb的大BAC,你也
有几亿个copy了，每个细胞能分到几十万个。
所以我建议你固定DNA的量，改变转染试剂的用量。
常用的转染试剂比如lipofectamine，lipofectamine 2000，FuGene 6， FuGene HD和
PEI都可以拿来试试。按照厂家建议的常用组合，每种试剂试3-4种就行了。这些试剂都
不贵。比起你1个月的时间来，都是小钱。
另外你用的是8-well plate？是不是typo？是6-well？试的时候用24-well就行了，这
样可以节省试剂，而且可以多试几种组合。细胞的接种密度也很重要，多试几个，大致
保证24小时后细胞密度在20-60% （1-3倍的初始接种密度差）。
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
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: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
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s*********t
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发帖数: 13035 | 16 以前ms讨论过。我们用lipofectamin ltx
【在 s******a 的大作中提到】
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发帖数: 472 | 18 谢谢两位
我决定先试试lipofectamine 2000
(实验室刚好有）
【在 s*********t 的大作中提到】
: 不难的，跟转普通质粒差不多。
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1199.html
: Lipofectamine 2000都可以的
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/extref/nmeth.1199-S1.
: 详细的protocol，照着做就行了。
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s******s
发帖数: 13035 | 19 ，其实效率不重要，反正最后你多半挑克隆，有那么几个就行了
【在 s******a 的大作中提到】
: 谢谢两位
: 我决定先试试lipofectamine 2000
: (实验室刚好有）
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发帖数: 472 | 20 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
所以现在唯一能确定的是转BAC DNA（我的约250kb）还是比普通质粒要难很多的。目前
对于lipo2000也已经没有idea了。
我现在开始尝试电转，第一次参数不合适细胞全死了，接下去准备降低电压和电容再试
试。
做过BAC转染的能否指点一下呢？
题外话：
实验室另一PhD,之前用lipo转过BAC，一开始口口声声他的protocol工作（同样的细胞
），不让我优化，我最后实在转不出来才开始优化。后来，我得知他所谓work就是8-
well nunc一个well中有5个阳性细胞（转染后48小时，这时候细胞已经很密）。就这他
还高高上上的教育我，有1个细胞就可以了。
【在 s*********t 的大作中提到】
: 不难的，跟转普通质粒差不多。
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/abs/nmeth.1199.html
: Lipofectamine 2000都可以的
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n5/extref/nmeth.1199-S1.
: 详细的protocol，照着做就行了。
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发帖数: 13035 | 21 确实有一个细胞转上就行了。效率低是肯定的
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
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发帖数: 472 | 22 问题是现在一个细胞也转不上:(
【在 s******s 的大作中提到】
: 确实有一个细胞转上就行了。效率低是肯定的
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: 350
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发帖数: 13035 | 23 你得细胞转普通质粒啥的好转么？有的细胞难搞
我一般也就转转fibroblast, 还是很容易的
【在 s******a 的大作中提到】
: 问题是现在一个细胞也转不上:(
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发帖数: 472 | 24 非常好，80-90%，你没有仔细读我上面的帖子啊。
【在 s******s 的大作中提到】
: 你得细胞转普通质粒啥的好转么？有的细胞难搞
: 我一般也就转转fibroblast, 还是很容易的
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发帖数: 638 | 25 1% efficiency is good enough, my cells can't even get 1%.
I have tried both electroporation and nucleofection for BAC, both work fine.
nucleofection is better and easier because reagents and parameters are
already optimized with the commerial kit.
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
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发帖数: 472 | 26 Thanks! I would have a try on nucleofection.
fine.
【在 l***y 的大作中提到】
: 1% efficiency is good enough, my cells can't even get 1%.
: I have tried both electroporation and nucleofection for BAC, both work fine.
: nucleofection is better and easier because reagents and parameters are
: already optimized with the commerial kit.
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: 350
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h******y
发帖数: 351 | 27 我建议你尝试几种不同的转染试剂，这比尝试DNA和lipofectamine的不同比例效率要高
。特定的转染试剂有时候在你的细胞株中就是不WORK，你怎么试也得不到好的效果。转
染中，DNA的量对结果影响最小，如果你用100ng的BAC DNA，即使是300Kb的大BAC,你也
有几亿个copy了，每个细胞能分到几十万个。
所以我建议你固定DNA的量，改变转染试剂的用量。
常用的转染试剂比如lipofectamine，lipofectamine 2000，FuGene 6， FuGene HD和
PEI都可以拿来试试。按照厂家建议的常用组合，每种试剂试3-4种就行了。这些试剂都
不贵。比起你1个月的时间来，都是小钱。
另外你用的是8-well plate？是不是typo？是6-well？试的时候用24-well就行了，这
样可以节省试剂，而且可以多试几种组合。细胞的接种密度也很重要，多试几个，大致
保证24小时后细胞密度在20-60% （1-3倍的初始接种密度差）。
350
【在 s******a 的大作中提到】
: 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
: 从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
: 我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
: 我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
: 第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
: lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
: 用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
: 这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
: lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
: ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
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发帖数: 472 | 29 不是typo，8-well Nunc plate，和ibidi差不多，做imaging用。
谢谢你的建议。
【在 h******y 的大作中提到】
: 我建议你尝试几种不同的转染试剂，这比尝试DNA和lipofectamine的不同比例效率要高
: 。特定的转染试剂有时候在你的细胞株中就是不WORK，你怎么试也得不到好的效果。转
: 染中，DNA的量对结果影响最小，如果你用100ng的BAC DNA，即使是300Kb的大BAC,你也
: 有几亿个copy了，每个细胞能分到几十万个。
: 所以我建议你固定DNA的量，改变转染试剂的用量。
: 常用的转染试剂比如lipofectamine，lipofectamine 2000，FuGene 6， FuGene HD和
: PEI都可以拿来试试。按照厂家建议的常用组合，每种试剂试3-4种就行了。这些试剂都
: 不贵。比起你1个月的时间来，都是小钱。
: 另外你用的是8-well plate？是不是typo？是6-well？试的时候用24-well就行了，这
: 样可以节省试剂，而且可以多试几种组合。细胞的接种密度也很重要，多试几个，大致
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