h*******0
发帖数: 14 | 1 正在克隆700bp片段到17kb质粒，试了好久，未果。试过将片段插入到pBlueskript(3kb
),效率很高，估计是载体问题。用一般的Qiagen柱子胶回收不了这个酶切过的质粒,只
好用spin-x,但效率很低，还需要PC8。我估计提高质粒的产量和质量会有助提高连接效
率。轻高手指教一下，谢谢。 |
J********n
发帖数: 534 | 2 "用一般的Qiagen柱子胶回收不了这个酶切过的质粒"
why?
加1倍体积的isopropanol，就可以了吧。 |
s******r
发帖数: 2876 | 3 你可以试试低熔点胶。
正在克隆700bp片段到17kb质粒，试了好久，未果。试过将片段插入到pBlueskript(3kb
),效率很高，估计是载体问题。用一般的Qiagen柱子胶回收不了这个酶切过的质粒,只
好用spin-x,但效率很低，还需要PC8。我估计提高质粒的产量和质量会有助提高连接效
率。轻高手指教一下，谢谢。
【在 h*******0 的大作中提到】
: 正在克隆700bp片段到17kb质粒，试了好久，未果。试过将片段插入到pBlueskript(3kb
: ),效率很高，估计是载体问题。用一般的Qiagen柱子胶回收不了这个酶切过的质粒,只
: 好用spin-x,但效率很低，还需要PC8。我估计提高质粒的产量和质量会有助提高连接效
: 率。轻高手指教一下，谢谢。
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h*******0
发帖数: 14 | 4 Qiagen的柱子主要是回收10kb以下的。加1倍体积的isopropanol并不能帮助回收这样大
的质粒（试过）。你试过这么大的质粒么？谢谢。 |
h*******0
发帖数: 14 | 5 什么是低熔点胶？为什么会帮助？不好意思，我孤陋寡闻。 |
b**y
发帖数: 70 | |
s******r
发帖数: 2876 | 7 就是low melting agarose,
run完胶，65 C 就可以融化，这儿有个protocol
http://thalamus.wustl.edu/nonetlab/ResourcesF/clone.html
不过要向干净的话，还是要phenol extract, ethanol precipitation.
不用kit，不会bind在柱子上。
什么是低熔点胶？为什么会帮助？不好意思，我孤陋寡闻。
【在 h*******0 的大作中提到】
: 什么是低熔点胶？为什么会帮助？不好意思，我孤陋寡闻。
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l*******1
发帖数: 128 | 8 You can use QiaEx II to recover DNAs up to 50kb:
http://www1.qiagen.com/Products/DnaCleanup/QIAEXIIGelExtractionSystem/QIAEXIIGelExtractionKit.aspx
3kb
【在 h*******0 的大作中提到】
: 正在克隆700bp片段到17kb质粒，试了好久，未果。试过将片段插入到pBlueskript(3kb
: ),效率很高，估计是载体问题。用一般的Qiagen柱子胶回收不了这个酶切过的质粒,只
: 好用spin-x,但效率很低，还需要PC8。我估计提高质粒的产量和质量会有助提高连接效
: 率。轻高手指教一下，谢谢。
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h*******0
发帖数: 14 | 9 我用过QiaEX II,效果也不好，产量也很低，也连不上去。 |
h*******0
发帖数: 14 | 10 谢谢。我试试这个low melting agarose protocol. |
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a********k
发帖数: 2273 | 11 最简单的办法，跑完胶把band切下来包在parafilm里面，直接用手把水挤出来。那些
TAE/TBE就可以直接用来做ligation了。效率不高，但是doable
【在 h*******0 的大作中提到】
: 谢谢。我试试这个low melting agarose protocol.
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l*******1
发帖数: 128 | 12 Sorry to hear that but I've used that for 20kb vector + 350bp insert.
And it worked for me.
【在 h*******0 的大作中提到】
: 我用过QiaEX II,效果也不好，产量也很低，也连不上去。
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h*******0
发帖数: 14 | 13 那你用什么方法大提质粒的？我用Qiagen的柱子却大提不出来，小提没问题，后来用
CsCl的老方法，提倒是提出来了，产量还是不高。请教一下。谢谢。 |
l*******1
发帖数: 128 | 14 I generally have no problems in midi preps for our transgenic constructs
which are usually around 15-21kb.
However, as suggested in the Qiagen protocols, you can pre-warm the elution
buffers to 65C to increase the yield of large plasmids. You could also try
to elute the DNAs slowly to increase the time needed for large DNAs to be
dissolved off the columns.
【在 h*******0 的大作中提到】
: 那你用什么方法大提质粒的？我用Qiagen的柱子却大提不出来，小提没问题，后来用
: CsCl的老方法，提倒是提出来了，产量还是不高。请教一下。谢谢。
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h*******0
发帖数: 14 | 15 This plasmid(villin-deta ATG) is really weird one. Thanks a lot for your
advice. I will give another try according to your advice. |
f**u
发帖数: 346 | 16 连接的时候试试看不要切胶回收载体，直接PCR回收
另外你可以用100ml或者更多的细菌做mini prep，
虽然按照protocol这么多体积应当作midi，
但是不用管它，把所有的裂解液都上到小柱子上再洗脱就是了，可以增加浓度。
【在 h*******0 的大作中提到】
: This plasmid(villin-deta ATG) is really weird one. Thanks a lot for your
: advice. I will give another try according to your advice.
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