w***y
发帖数: 493 | 1 基因大概有2.6KB, PCR克隆后链接到质粒里然后转到E.coli里面扩增，做小抽然后把质
粒送去测序发现基因的两端都连进去了但是中间部分丢失。测序过几次丢失的部分好像
没什么规律，有时2kb,有时800bp。 PCR的产物还没有测序，因为看size是正确的。请
问这种情况是怎么回事？是不是菌种的问题呢？这个基因是zebrafish的基因。谢谢 |
w***y
发帖数: 493 | 2 自己顶顶~
【在 w***y 的大作中提到】
: 基因大概有2.6KB, PCR克隆后链接到质粒里然后转到E.coli里面扩增，做小抽然后把质
: 粒送去测序发现基因的两端都连进去了但是中间部分丢失。测序过几次丢失的部分好像
: 没什么规律，有时2kb,有时800bp。 PCR的产物还没有测序，因为看size是正确的。请
: 问这种情况是怎么回事？是不是菌种的问题呢？这个基因是zebrafish的基因。谢谢
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m*p
发帖数: 226 | 3 pcr cloning 经常发生片段丢失。
【在 w***y 的大作中提到】
: 基因大概有2.6KB, PCR克隆后链接到质粒里然后转到E.coli里面扩增，做小抽然后把质
: 粒送去测序发现基因的两端都连进去了但是中间部分丢失。测序过几次丢失的部分好像
: 没什么规律，有时2kb,有时800bp。 PCR的产物还没有测序，因为看size是正确的。请
: 问这种情况是怎么回事？是不是菌种的问题呢？这个基因是zebrafish的基因。谢谢
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Z******5
发帖数: 435 | 4 做过很多克隆，这种问题还没碰到过。
建议换几个宿主菌试试，比如DH5a，TOP10等都试试。 |
d***y
发帖数: 8536 | 5 你质粒有没有酶切，然后跑胶，看看目标片断有没有缺失？ |
h**********r
发帖数: 671 | |
w***y
发帖数: 493 | 7 谢谢回复, 我曾经尝试酶切这个质粒再跑胶, 发现目标片段的长度确实跟测序的结果一
样. 中间的部分丢掉了
【在 d***y 的大作中提到】
: 你质粒有没有酶切，然后跑胶，看看目标片断有没有缺失？
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n***w
发帖数: 2405 | 8 你测序用了几对引物？
如果就光用头尾的引物的话，一般测序差不多1kb吧，你中间自己设计引物了吗？ |
s*****i
发帖数: 315 | 9 酶切鉴定一下，你可以选你怀疑缺失了的片段中特有的酶切位点
如果用两端的酶切size正确应该没有问题。 注意NEB buffer4 在TBE buffer里面跑得
会滞后，也就是看上去条带的size比实
际的大。
如果确定丢失了，说明你的基因里面有重复序列，被重组掉了，可以选择invitogen
stbl3 strain来做
【在 w***y 的大作中提到】
: 基因大概有2.6KB, PCR克隆后链接到质粒里然后转到E.coli里面扩增，做小抽然后把质
: 粒送去测序发现基因的两端都连进去了但是中间部分丢失。测序过几次丢失的部分好像
: 没什么规律，有时2kb,有时800bp。 PCR的产物还没有测序，因为看size是正确的。请
: 问这种情况是怎么回事？是不是菌种的问题呢？这个基因是zebrafish的基因。谢谢
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i**********5
发帖数: 261 | 10 recombinations due to repeat sequences. use Sure cell, not regular cells
for transformation. |
w***y
发帖数: 493 | 11 有3对引物, 第一个引物的测序中就发现了deletion. 我想不是引物的问题.
【在 n***w 的大作中提到】
: 你测序用了几对引物？
: 如果就光用头尾的引物的话，一般测序差不多1kb吧，你中间自己设计引物了吗？
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w***y
发帖数: 493 | 12 谢谢回复, 我再仔细看一下这个重复序列的问题. 我想很有可能是这个原因吧.
【在 s*****i 的大作中提到】
: 酶切鉴定一下，你可以选你怀疑缺失了的片段中特有的酶切位点
: 如果用两端的酶切size正确应该没有问题。 注意NEB buffer4 在TBE buffer里面跑得
: 会滞后，也就是看上去条带的size比实
: 际的大。
: 如果确定丢失了，说明你的基因里面有重复序列，被重组掉了，可以选择invitogen
: stbl3 strain来做
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w***y
发帖数: 493 | 13 谢谢你! 我会用别的细胞试试看.
【在 i**********5 的大作中提到】
: recombinations due to repeat sequences. use Sure cell, not regular cells
: for transformation.
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m*****u
发帖数: 15526 | 14 为啥会丢失？
【在 m*p 的大作中提到】
: pcr cloning 经常发生片段丢失。
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