Q*****n
发帖数: 4546 | 1 想纯化一些tRNA，看到的文献里用的都不是我们平常用的pET或类似的质粒，不知道
tRNA的克隆跟蛋白基因的克隆是不是不大一样，请有经验的说几句 |
l******g
发帖数: 1623 | 2 不行的，tRNA和mRNA用不一样的polymerase
【在 Q*****n 的大作中提到】
: 想纯化一些tRNA，看到的文献里用的都不是我们平常用的pET或类似的质粒，不知道
: tRNA的克隆跟蛋白基因的克隆是不是不大一样，请有经验的说几句
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s******s
发帖数: 13035 | 3 没做过。不过显然不行
【在 Q*****n 的大作中提到】
: 想纯化一些tRNA，看到的文献里用的都不是我们平常用的pET或类似的质粒，不知道
: tRNA的克隆跟蛋白基因的克隆是不是不大一样，请有经验的说几句
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z*********8
发帖数: 1203 | 4 刚刚做过点。需要先用invitrogen的small RNA kit提总的小RNA,大概好像是250nt一下
的，然后你可以用biotinylated oligo pull down的方法。yield还可以，可以到几个
ug. |
z*********8
发帖数: 1203 | 5 BTW,我做的是细菌的tRNA,只有75nt左右，所以肯定在那个Kit的范围里，如果你是什么
别的真核生物的，就不知道了。因为没查过他们的tRNA多大。不知道可以用这个kit不
。但是你说你要over expression tRNA的话，我就不知道了。 |
Q*****n
发帖数: 4546 | 6 谢谢回复。我是想提E.coli的tRNA，想先over express，不然产率大概太低了；不过我
也看到有人说overexpress的可能不够均一，因为负责后期加工的酶处理不过来，所以
有点犹豫要不要直接提
【在 z*********8 的大作中提到】
: BTW,我做的是细菌的tRNA,只有75nt左右，所以肯定在那个Kit的范围里，如果你是什么
: 别的真核生物的，就不知道了。因为没查过他们的tRNA多大。不知道可以用这个kit不
: 。但是你说你要over expression tRNA的话，我就不知道了。
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Q*****n
发帖数: 4546 | 7 那个biotinylated oligo是针对一个tRNA还是所有tRNA的？另外这个yield是从多少菌液得到的？
【在 z*********8 的大作中提到】
: 刚刚做过点。需要先用invitrogen的small RNA kit提总的小RNA,大概好像是250nt一下
: 的，然后你可以用biotinylated oligo pull down的方法。yield还可以，可以到几个
: ug.
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z*********8
发帖数: 1203 | 8 oligo是sequence specific，所以纯化出来的是single species tRNA.
我做的菌是mycobacterium，我用了1升。我估计你用ecoli的话1升也应该够了。 |
z*********8
发帖数: 1203 | 9 谢谢回复。我是想提E.coli的tRNA，想先over express，不然产率大概太低了；不过我
也看到有人说overexpress的可能不够均一，因为负责后期加工的酶处理不过来，所以
有点犹豫要不要直接提.
建议不要这么做，yield很高，因为tRNA很abundant.你提的small RNA里面70%以上都是
tRNA。假若你用1Liter的菌，一个不小心提完了small tRNA就有500ug之类的。然后你
再pull down，少说还是有1-2ug。overexpression我估计不会work. |
z*********8
发帖数: 1203 | 10 最后需要提醒的是纯化完了的tRNA最好跑bioanalyzer.最少看看质量，和大小符合不。
因为做一次需要的工还不少。所以最好有quality check。 |
h**********r
发帖数: 671 | 11 这个真不知道。不过BL21(DE)3的rossetta系列都有额外的tRNA,在一个p15 ori的低拷
贝质粒里，名字一般为pRARE或者pRARE2. |
Q*****n
发帖数: 4546 | 12 我还有一个疑问，你用biotinylated oligo pull down，是不是要用到高温退火，那然
后tRNA还会回到它天然的结构吗？
【在 z*********8 的大作中提到】
: 最后需要提醒的是纯化完了的tRNA最好跑bioanalyzer.最少看看质量，和大小符合不。
: 因为做一次需要的工还不少。所以最好有quality check。
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z*********8
发帖数: 1203 | 13 具体退火温度要具体计算.回不回到天然结构我不知道。因为我当时的目的只是看一个
identity 和有没有amino-acylated。这个问题你需要问下tRNA expert |
