s**x
发帖数: 138 | 1 我现在做一个MUTATION。那到菌落后， 提DNA。可是我的DNA SEQUENCE 结果非常糟糕
。测出来的也不知道是什么。根本不对。 SIGNAL／NOISE 比例特低。 DNA QUALITY是
，没有问题的。我测过OD。而且是溶在水里的。用的是T７的PRIMER。 SELECTIVE
ANTIBIOTICS 是 CHLORAMPHENICOL。 我想知道： 大家如遇到这中情况是解决的？
CHLORAMPHENICOL 大家是如何使用的？ 我的是溶在酒精。多谢多谢。 已经纠缠１个月
了。 有点伤自尊啦 。 |
T**********t
发帖数: 1604 | 2 DNA quality和你用的antibiotics没什么必然联系吧。Chloramphenicol用酒精溶没什
么错。
你的质粒是怎么提的？DNA quality不是光看OD就行了啊。你做过限制酶切然后跑胶看
么？你送去测序的质粒浓度是多少？太浓或者太稀都可能测不好，质粒测序的模板用量
在200-500ng之间结果最好。 |
s**x
发帖数: 138 | 3 extracted DNA with mini prep. as required, DNA concentration is 50ng/ml.any
suggestion is greatly appreciated. |
h******g
发帖数: 1521 | 4 做酶切确定是那个质粒，有的时候质粒污染不是你做的那个，sequencing primer自然
粘不上。 |
l*****a
发帖数: 1431 | 5 DNA 量可以再减，mini prep 的时候如果用太多的细菌，会overflow 你的column，造
成太多杂质和盐混在DNA 溶液里，然后影响 sequencing reaction. |
T**********t
发帖数: 1604 | 6 50ng/ml还是50ng/ul啊？前者的话，就太稀了。 |
d****a
发帖数: 158 | 7 design your own sequencing primers. purify DNA. |
C*******e
发帖数: 4348 | 8 就是50 ng/ul也有点低
有的时候可以测出来
不过一般都会要求在100 ng/ul以上吧
跑个胶看看
另外乙醇沉淀、浓缩一下 |
T**********t
发帖数: 1604 | 9 50ng/ul够了啊，多加几微升不就行了。:) 我送过20ug/ul的样品也测出来过的。关键
还是要够纯。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 就是50 ng/ul也有点低
: 有的时候可以测出来
: 不过一般都会要求在100 ng/ul以上吧
: 跑个胶看看
: 另外乙醇沉淀、浓缩一下
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n***w
发帖数: 2405 | 10 做出来先做个pcr什么的，确定一下，然后测序。。。
lz总比我上次遇到的要好一些。。。
我提完以后，跑了pcr，发现，嗯，那个条带在那里，说明我插到ta vector了，可是测
序回来，t7和sp6返回的基本都差不多，就那100bp左右。。我傻了。。。其他2.3kb呢
。。。。 |
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s**x
发帖数: 138 | 11 我可能犯了一个错误。 我只是MUTATE 一个AA，而我用的是MULTI－MUTATION 的 KIT。
（现有的）。我不知两个KIT有何不同。MILTI KIT是否可用在SINGLE AA MUTATION 上
。 |
l***C
发帖数: 334 | 12 没事
【在 s**x 的大作中提到】
: 我可能犯了一个错误。 我只是MUTATE 一个AA，而我用的是MULTI－MUTATION 的 KIT。
: （现有的）。我不知两个KIT有何不同。MILTI KIT是否可用在SINGLE AA MUTATION 上
: 。
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g*****y
发帖数: 6325 | 13 1. 用的什么competent cell
2. 你spin down cell 的时候离心机多少转速。
3. mini prep的p1 有没有加Rnase. 是不是保存冰箱里。
4. mini prep 时, 加p2后有没有超过5 分钟？
5.mini prep 加p3后是怎么mix的
6.你用的水有没有auto clave.
7.你pick了多少colony?
【在 s**x 的大作中提到】
: 我现在做一个MUTATION。那到菌落后， 提DNA。可是我的DNA SEQUENCE 结果非常糟糕
: 。测出来的也不知道是什么。根本不对。 SIGNAL／NOISE 比例特低。 DNA QUALITY是
: ，没有问题的。我测过OD。而且是溶在水里的。用的是T７的PRIMER。 SELECTIVE
: ANTIBIOTICS 是 CHLORAMPHENICOL。 我想知道： 大家如遇到这中情况是解决的？
: CHLORAMPHENICOL 大家是如何使用的？ 我的是溶在酒精。多谢多谢。 已经纠缠１个月
: 了。 有点伤自尊啦 。
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g*****y
发帖数: 6325 | 14 50ng/ml这个浓度非常非常的低。一般 至少都是50ug/ul
any
【在 s**x 的大作中提到】
: 我可能犯了一个错误。 我只是MUTATE 一个AA，而我用的是MULTI－MUTATION 的 KIT。
: （现有的）。我不知两个KIT有何不同。MILTI KIT是否可用在SINGLE AA MUTATION 上
: 。
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c***y
发帖数: 615 | 15
【在 s**x 的大作中提到】
: 我现在做一个MUTATION。那到菌落后， 提DNA。可是我的DNA SEQUENCE 结果非常糟糕
: 。测出来的也不知道是什么。根本不对。 SIGNAL／NOISE 比例特低。 DNA QUALITY是
: ，没有问题的。我测过OD。而且是溶在水里的。用的是T７的PRIMER。 SELECTIVE
: ANTIBIOTICS 是 CHLORAMPHENICOL。 我想知道： 大家如遇到这中情况是解决的？
: CHLORAMPHENICOL 大家是如何使用的？ 我的是溶在酒精。多谢多谢。 已经纠缠１个月
: 了。 有点伤自尊啦 。
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c***y
发帖数: 615 | 16 where did you send for sequencing?
【在 c***y 的大作中提到】
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s**x
发帖数: 138 | 17 我用的是stratagene kit。做了很多的mini prep，没问题的。今天我酶切了质粒。
mutate之前的事没问题的。可之后的就切不出任何bands。 明天我问问公司，看我是否
用错。 |
T**********t
发帖数: 1604 | 18 用Qiagen的mini prep kit最好。
“切不出任何bands”，是说根本看不到条带是么？那更可能是浓度太低了。 |
s**d
发帖数: 325 | 19 看起来像是突变不成功。是不是菌落非常少？
【在 s**x 的大作中提到】
: 我用的是stratagene kit。做了很多的mini prep，没问题的。今天我酶切了质粒。
: mutate之前的事没问题的。可之后的就切不出任何bands。 明天我问问公司，看我是否
: 用错。
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A*****i
发帖数: 5 | 20 我是做DNA sequencing的，我们公司在湾区，如果你也是在湾区的话可以和我联系，我
们免费帮你做几个titration testing,做测序这个东西有可能不是DNA本身的问题，我
们做反应的条件也非常重要，或者说你DNA本身容易形成secondary strucutre的话（G/
C rich),结果也会不好。你所说的signal/noise低有可能是他们做反应的时候DNA的量
不够或者PCR cycle不够，一般你送几个样品的话他们是不会每个用户都优化反应条件
的。如果你不在湾区，你可以叫你用的那家公司加大反应量，用150ng,300ng和600ng
template做个titration。如果你想把样品寄来我们公司试一下的话请和我联系，湾区
附近的公司和大学我们都是免费pick up的。我们第一次帮你做都是免费的。我email:
l****[email protected]，good luck! |
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e****s
发帖数: 1125 | 21 有没有做digestion test?
同时做一下single 和double digestion test,看看酶切位点对不对，Size对不对。
【在 s**x 的大作中提到】
: 我现在做一个MUTATION。那到菌落后， 提DNA。可是我的DNA SEQUENCE 结果非常糟糕
: 。测出来的也不知道是什么。根本不对。 SIGNAL／NOISE 比例特低。 DNA QUALITY是
: ，没有问题的。我测过OD。而且是溶在水里的。用的是T７的PRIMER。 SELECTIVE
: ANTIBIOTICS 是 CHLORAMPHENICOL。 我想知道： 大家如遇到这中情况是解决的？
: CHLORAMPHENICOL 大家是如何使用的？ 我的是溶在酒精。多谢多谢。 已经纠缠１个月
: 了。 有点伤自尊啦 。
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s**x
发帖数: 138 | 22 please read pics.
http://www.flickr.com/photos/14129094@N08/4822251530/
1: undigested: pre- PCR and 4 colonies DNA
2: digested (ecroR I and xhoI): pre-PCr and post-PCR colonies DNA(pre-PCR
result is correct). i guess the problem is PCR (kit did not work?) |
s**x
发帖数: 138 | |
T**********t
发帖数: 1604 | 24 看起来你突变后挑菌落做的miniprep量是没问题的，可是size好像差太多了。而且双酶切只有两个酶切位点，和突变之前的质粒差别太大了。我觉得是质粒出错了，会不会转化的时候污染了其他质粒，挑错了菌落。如果miniprep出来的质粒是错的，还用原来的测序引物去测，因为引物不对，当然就测不出来了。
看了一下前面的回复，4楼的同学早就言简意赅的说过了。 |
s**e
发帖数: 1523 | 25 你搞笑吧？大提出来最高也就3ug/ul顶多了，哪来的50ug/ul。。。
【在 g*****y 的大作中提到】
: 50ng/ml这个浓度非常非常的低。一般 至少都是50ug/ul
:
: any
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C*******e
发帖数: 4348 | 26 这个要看的吧，20ng/ul不可能每次都测出来对不对
而且一般测序测不出来你complain，人家测序中心一跑胶，就会跟你说你的质粒浓度不够
又不是自己测序，可以掌握多加少加
【在 T**********t 的大作中提到】
: 50ng/ul够了啊，多加几微升不就行了。:) 我送过20ug/ul的样品也测出来过的。关键
: 还是要够纯。
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C*******e
发帖数: 4348 | 27 人家肯定是笔误啦
【在 s**e 的大作中提到】
: 你搞笑吧？大提出来最高也就3ug/ul顶多了，哪来的50ug/ul。。。
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