s****a
发帖数: 55 | 1 我做全长RNA然后测序看到的，主要是关心这个小RNA自身的功能。只是好奇这些末端的
多态性到底有什么作用。
另外，我的小RNA大概有60个bp. |
|
f*******a
发帖数: 671 | 2 我打算做RNA-seq,但是我这批samples的RNA量在20~100ng之间.这种情况下用什么扩增
方法比较好?
Nugen的Ovation RNA seq system怎么样?
Clontech SMARTer Technology呢? 有人用过吗?
谢谢? |
|
z**********8
发帖数: 766 | 3 谢谢各位回复！
问过我们的facility，没有MagNA，老板不可能现在去买 ：（
细胞离心后的沉淀已经冻存在-80，当时没有加lysis buffer或RNAlater，现在只能抽
提RNA前立即放在干冰上加RLT buffer。
有人有qiagen kit的经验吗？是不是用RNAeasy只抽RNA会比抽DNA和RNA更好？ |
|
c*********r
发帖数: 1312 | 4 有好的抗体吗？
有的话能不能做CoIP，然后提取RNA做RNA-seq？
我的目标蛋白是localized，计划用类似的方法看这个complex里有没有localized RNA
。不知道是否可行。 |
|
r**a
发帖数: 121 | 5 谢谢各位的建议。
目前，我们还不准备做RNA-seq,觉得耗费是不是太大了
我们第一步，只是想证明这个是RNA binding的蛋白
我们目前有一个myc tag的蛋白，在转在果蝇里面（我们是做果蝇的），而且是
functional的，所以可以用这个抗体，但是在果蝇里面好象没有好的办法标记RNA （我
不知道能不能尝试，用oligo dT的beads，pulldown，能不能拉下我的蛋白？）
还有一个，我们已经在那个HTH motif做了点突变，有几个突变体有很好的现象，
所以我们还想进一步证明，这个作用是通过这个区域进行的。
所以，只要是一个体外的实验，证明上面两点就可以了。
midwestPhD大哥的方法不错，就是我个人对这个EMSA有点怵（听说挺麻烦的），以前硕
士的时候帮一个师兄一起搞过，没有做出来。 |
|
c*********r
发帖数: 1312 | 6 不做RNA-seq也可以用抗体pull down，提RNA，测一下有没有RNA；如果有的话，可以进
一步反转录合成cDNA、dsDNA做个library，然后克隆测序吧。我想。 |
|
r**a
发帖数: 121 | 7 如果这个方法可行，是最好的拉。
不过不好意思，对RNA，不适特别在行，
请问，这里怎么提取RNA，然后测RNA呢？
总不至于Nanodrop测浓度吧？
还有弄成cDNA之后，用随机引物合成dsDNA？
谢谢先了；－） |
|
i***l
发帖数: 1656 | 8 同意上面几位有具体内容的意见，补充2点，
1. 大多数的实验是要比较不同Sample中的目的基因，所以应该把各个Sample的总RNA量
调成差不多的量
2. 每个RT Kit都会对Input RNA的量有个范围规定，比如我记得Invitrogen的
SuperScript3就是2-10Ug的总RNA吧，你当然不能超出这个范围。 |
|
x*****d
发帖数: 704 | 9 1.RNA提纯。Ribosomal RNA depletion （千万别用poly A selection）
2.RNA-Seq，最好50bp，80million reads以上。推荐Illumina HiSeq
3.Reads alignment，abundance estimation. 用Tuxedo Suite，http://www.nature.com/nprot/journal/v7/n3/full/nprot.2012.016.html
4.分析。这就比较麻烦了，一般是先在cufflink输出的gtf文件找novel transcript，
然后再用IGV看具体的coverage。
5.validation。 |
|
c***y
发帖数: 615 | 10 我现在是有一批cufflinks assembled transcripts which does not seem to
contains coding frame. 也就是连续翻译的长度<30 amino acids.
这个结果是来自deep-seq, RNA是经过polyA selected.
看有些文献说long noncoding RNA 是可能含有polyA tail的。 所以在想是不是应该考
虑这些 tanscripts 是 long non-coding RNA.
不过我承认， 这方面东西我还读得太少。。。 |
|
c*z
发帖数: 157 | 11 是的，公司多数用Qubit测浓度，可以比nanodrop低一半，但是100倍的话，估计是进了
rnase....
我觉得lz的东西是被降解了，新鲜组织rna质量不会太差的
illumina在aacr present了 fixed tissue RNA seq, 只要QC出来80%的RNA大于200nt就
可以 |
|
I*******h
发帖数: 99 | 12 RNA-Seq does not need exome enrichment and can detect RNA level. What is the
disadvantage of RNA-seq compared to whole exome sequence? |
|
z****u
发帖数: 1007 | 13 准备开始做RNA sequencing .从小鼠的incisor里面提取细胞，一个incisor能sort出大
概600个细胞。计划用30只小鼠，每个小鼠取俩下颌incisor, sort出大概3万个target
细胞。
按有些信息来源说大概从30K细胞能抽出来 0.5 ug的 RNA
问：
够不。
要是不够有啥别的办法做。扩增靠谱不。
--------------------------------
我的摄影作品网站
www.oxygenfoto.com |
|
D*a
发帖数: 6830 | 14 跟你们RNA seq的人谈。现在有single cell RNA seq了。如果你搞30只都混到一起，才
一个点，没有biological replicate，也不一定做出来的数据就有什么意义。你最好先
找好分析数据的人，和做那个的facility，先谈完了再去杀老鼠，省得白杀了
本人也是小白，最近课题有点扯到这个了，以上是个人理解，欢迎纠正。 |
|
r*****q
发帖数: 216 | 15 本人想创业 做个RNA-seq preprocessing tool 提供一整套在 local machine 上run
的solution. 使用的是标准的Tuxedo suite。 面向没有太多的编程基础的用户 但又由
于工作需要 需要做bioinformatics analysis.
想调查一下有多少人感兴趣 看看市场是不是真的存在。
希望大家能够帮忙. 分享一下你们现在在做 RNA-seq分析时所遇到的最大的问题。
譬如,不熟悉Linux 环境？对RNA-seq analysis 不了解？ 现有的tool 太难用？ 比如
说 Galaxy.
先谢过各位的关注和留言！ |
|
w*e
发帖数: 740 | 16 前阵子参加一个会议，有人podium 演讲提及到可以做non coding RNA 基因的GFP gene
targeting, 目的是用GFP 来看non coding RNA 基因的基因表达。我不解的是：既然
是non coding RNA, 这样做的话gfp会表达么？还是强制加上一个kozak序列让gfp开始
翻译？
谢谢 |
|
J**a
发帖数: 215 | 17 谢谢了！我做了TapeStation RNA Tape, 所以看的不是一个target mRNA transcript，
而是所有的total RNA profile。IP前后的RNA在TapeStation跑出来都是rRNA占绝大多
数，18S和28S的2个peak都很高。不知道TapeStation对mRNA的sensitivity怎么样，但
是我assume 18S，28S两个峰底下那些background就是mRNA，看上去这些mRNA并没有明
显的相对于18S,28S的峰有enrich。。。不知道这个正常么？ |
|
x*****d
发帖数: 704 | 18
推荐先看看这篇review：
Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing |
|
l********e
发帖数: 415 | 19 Rneasy Kits worked fine for us.
You do need to remove DNA as they can be incorporated into the sequencing
library.
However, DO NOT perform the standard on-column DNase treatment as it lead to
dramatic sample loss and often times not complete. I would just Dnase the
sample after purification and heat inactivate.
Please note that the regular Rneasy columns do not work well with RNA <
200bp. Therefore, if you want to look at small RNA, you might need a special
kit. |
|
v********a
发帖数: 646 | 20 请问，我有一个5‘端没有磷酸化的体外化学合成的RNA:
5'OH---RNA----3'Dig
请问，这个RNA可以反转录合成cDNA么？谢谢！ |
|
c*********r
发帖数: 1312 | 21 如果做IP之后提取RNA做RNA-seq的话，是不是IP的每一步都要加RNase inhibitor？求
一些成熟的protocol和相关文章、资料。
计划做一个side project，看看目标蛋白都结合哪些RNA。 谢谢！ |
|
d***s
发帖数: 1062 | 22 做了一个rna-seq，core给了我们一个excel file。里面有一个很长的list of gene，
每个gene有对应的pvale，logFC，和每个sample的raw read counts以及FPKM。
GSEA是用来分析microarray data，但是网站上说也可以分析RNA-seq data。研究了半
天没搞明白。
1.不知道数据格式怎么转换。
2.不懂GSEA Preranked analysis是什么，这个prerank 是必须的嘛？
3.因为是RNA-seq，怎么选chip platform？
4.怎么让我的list里的gene name对应上MsigDB里的gene name？
求大牛帮忙。先谢谢了。 |
|
S**********e
发帖数: 620 | 23
没错，rip不知道target没法测量，clipseq步骤非常复杂（建议hcy有空挑战一下这个
实验就知道什么叫做高潮技巧），背景高。建议如下
1，gelshift，当然得知道和什么rna结合，才可以标签。
2，如果没有可以try的序列，clip做到标记那一步骤，看看有没有特异信号，必须是
rnaseh霉resistant的信号，这个基本上算金标准。
2，domainmapping，看看哪段aa去掉之后失去结合活性
3，确定之后，clip，seq做目标seq
4，把序列RNA找到，做KO，看是不是下游活性受到影响。怎么影响，RNA功能，还是稳
定性。
做到这4点，基本结果令人信服了。不造假的前提下，必需抱着中彩票的信心。 |
|
x**********o
发帖数: 142 | 24 RNA主动识别DNA很常见，真核生物与原核生物中都有专门的RNA 聚合酶去催化，但DNA
片段主动识别RNA我似乎是没什么印象，各位高手谁能举点例子 |
|
q**********0
发帖数: 335 | 25 请教高人：将一个细菌感染的人组织标本中的细菌RNA和人RNA分离开作细菌的
transcriptome分析，用什么方法／技术？谢谢先！ |
|
w******e
发帖数: 1187 | 26 我用的RNA约80base，2'-F modified。直接用chemical synthesis同时加functional
group太贵，只好自己从DNA template trancribe出RNA，同时加amino-GMP在
5’加amino group，再从amino group变成其他functional group using NHS
ester.
我不是化学出身所有上述都是第一回做，提心吊胆，每步的yield也不知道怎么
确定。不知道有没有公司会
提供外包服务，我提供RNA，帮我在两端加上各种group？非常感谢！ |
|
C******6
发帖数: 22 | 27 积累了二十多年，2013 年爆发。股票长了258%。Kynamro 产品销售前景不看好，但对
将来制药厂行业方向有重大影响。350 人，市值46亿美元，平均13M/person。
Isis Pharmaceuticals , Inc. (NASDAQ:ISIS)‘ Kynamro probably isn’t going to
reach blockbuster status anytime soon, if ever. The drug treats a rare
disease that causes patients to have dangerously high cholesterol levels.
And it appears Aegerion Pharmaceuticals, Inc. (NASDAQ:AEGR)‘ Juxtapid,
which was approved in late 2012, will take most of the market.
But the approval makes the top three for 2013 because Ky... 阅读全帖 |
|
a****o
发帖数: 1786 | 28 Journal Club 1: Paused RNA polymerase and bidirectional transcription
谢绝转载
我来抛砖引玉了，其实不是砖，是坯
In the last issue of 2008, Science published 4 related papers about paused
RNA polymerase and bidirectional transcription. I would like to briefly
summarize the history of these studies and how they would influence our
understanding of transcription.
Paused polymerase
The first well known example of paused (stalling) RNA polymerase was
described about 20 years ago by John Lis and colleagues at Cornell
Uni |
|
a****o
发帖数: 1786 | 29 考古呀
Although RNA polymerase only use one strand as template during transcription
, both strands get into RNA polymerase and separate around Mg ++, so
collision is inevitable for head-to-head transcbing RNA polymerases.It is
not like DNA polymerase, which only take one strand of DNA into its active
center.
and
strand |
|
a****o
发帖数: 1786 | 30 someone discuss this before on Biology board and I post here.
It is a great technology, although it has its own shortcomings:
1. since this technolgy relies on poly A tail for sequencing, RNA without
poly A tails can not be sequenced directly (this can be overcomed by
ligating a polyA tail to all RNA molecules)
2. the length of poly A tail will affect capture of RNA molecules on flow
cells (the longer the better, but too long may affect later sequencing)
3. it can only sequence the very 3' end o |
|
x****6
发帖数: 4339 | 31 带电云层里经常闪电，海底热泉口的温度很高，
两个环境都是带有巨大的能量和巨大的热噪音。这样的条件，化合物之间的反应会异常
活跃和频繁。一些不容易切断的化学键会断，一些不容易反应的基团之间会反应。再这
样很动态的环境里，给定时间足够长，从氨基酸到RNA只是时间问题。
但是一般认为，RNA先于氨基酸出现。 |
|
发帖数: 1 | 32 夏老师号称搞生物，但是不懂病毒，RNA更加不会懂。应该肯定懂的几把比RNA多。 |
|
发帖数: 1 | 33 换成什么都没用.
你还不如这两位说的好. 你自己在编一个主流的说法. 以为用了 "主流"这个词,别人就
怕了.
信人: keystone0504 (金牛), 信区: Military
标 题: Re: 今天最佳 "一群氨基酸靠自然反应生成RNA"
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Aug 10 16:46:31 2018, 美东)
就是一群无机物怎么形成有机生命物质的意思，又不是发文章
发信人: oIdMo (amigo), 信区: Military
标 题: Re: 今天最佳 "一群氨基酸靠自然反应生成RNA"
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Aug 10 16:51:16 2018, 美东)
鸡可以生蛋，蛋也可以生鸡。
先有蛋还是先有鸡，是恒古不变的话题 |
|
h***u
发帖数: 90 | 34 Job description
The Laboratory of Dr. Housheng Hansen He at the Ontario Cancer Institute and
the University of Toronto is focused on elucidating the functional role of
epigenetic regulation in cancer development and progression, with a special
focus on interplay between epigenetic regulators and noncoding RNAs. The lab
is utilizing and developing cutting edge experimental and computational
methods based on next-generation sequencing. One computational and two
experimental postdoctoral-fellows wi... 阅读全帖 |
|
h***u
发帖数: 90 | 35 Job description
The Laboratory of Dr. Housheng Hansen He at the Ontario Cancer Institute and
the University of Toronto is focused on elucidating the functional role of
epigenetic regulation in cancer development and progression, with a special
focus on interplay between epigenetic regulators and noncoding RNAs. The lab
is utilizing and developing cutting edge experimental and computational
methods based on next-generation sequencing. One computational and two
experimental postdoctoral-fellows wi... 阅读全帖 |
|
T*J
发帖数: 116 | 36 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: TMJ (Temporomandibular Joint), 信区: Biology
标 题: EDTA影响Reverse Transciprtion(RNA->DNA)转化吗？
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Aug 6 00:33:22 2008), 转信
RNA保存在0.1mM EDTA中，用不用centrifuge出来在做
RT。不知道EDTA会不会影响RT反应呢？用的是AB 的
high-capacity cDNA kit/
谢谢哦 |
|
j*****7
发帖数: 4348 | 37 说出来要挨骂的，这个秘密就是
-男人的直觉
大概的原因如下：
1) Pipeline上还有其它货色，虽然都是早期的，也不能说是一钱不值的。
2) SRPT的专利在欧洲被RNA给bloack住了，所以说呢，如果SRPT的药成了，想在欧洲卖
的话，还得过RNA或者是法庭这关。看看SRPT最近这半年涨了多少。 |
|
发帖数: 1 | 38 If anyone wants to review the following manuscript, please send me your
contact information and CV.
fBackground: epigenetics, non-coding RNA, cancer.
Title: Over-expression of long intergenic noncoding RNA LINC00312 inhibits
the invasion and migration of thyroid cancer cells via down-regulating
microRNA-197-3p |
|
y****c
发帖数: 7 | 39 thanks to all guys who help me.
nucleotides的啊。我没有做过跟RNA相关的实验，但是RNA是
，可以
每次实验
，争取1 |
|
t*****t
发帖数: 27 | 40 Avoid RNase contamination. UseDEPC-treated autoclaved H2O to dissolve RNA and
to make all the reagents for RNA assays.Wear gloves
Avoid repetitive freeze-thaw
窍 |
|
t***u
发帖数: 230 | 41 It really depends on the GC content of your RNA. My suggestion is to shuffle
and generate a random pool (say, 100) of your RNA based on the GC content.
Then run them through mfold (the server can handle batch jobs, you just need
to wait for a while), and then you will have a normal distribution of the
folding free energy. Compare the folding free energy of your native sequence
to the distribution will show you whether it's better or worse than random. |
|
M****e
发帖数: 70 | 42 i have never worked with plant, so i do not know whether this
could be due to sth that cuase higher obsorbance at 260nm.
the ratio for isolated RNA from animal tissues is usually 1.7-
2.0 for my experience, and it pretty much depends upon what
kind of kit/reagent i use. i try TRIZol (Invitrogen), which
is pretty good, but sometimes RNA from pancreas will degrade
with no mercy. i also use RNeasy Kit (Qiagen), which is said
to be better, particularly working for microarray purpose.
i would recomme |
|
f******s
发帖数: 115 | 43 我提取完组织后立刻放到rna later (qiagen)中 4摄氏度过夜后转到-20度 2周后开始
提取rna 但是发现里面有冰块？还是结晶块？这些东西要还是不要？我后面用trizol法
提 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 44 这种情况理论上是有的，比方说有的调控蛋白可以结合在某些RNA的UTR region，
使得某一个时间只能有一定浓度的RNA进行表达，多余的就不能表达。
但是我一下子想不起什么文章中提到类似现象 |
|
q**********0
发帖数: 335 | 45 There are two RNAs, one is about 1800bp, one is 200bp, how to know these two
RNA molecule will complementary to each other? What kind of software we can
use? Thanks. |
|
|
a*****i
发帖数: 361 | 47 我想要非同位素来标记RNA,然后要用EMSA来检测RNA protein interaction.
在网上找了一些，但不知道有没有人做过这方面的，有那家公司的kit比较方便好用？
非同位素标记看到最多的就是生物素，还有别的？
谢谢！ |
|
f******g
发帖数: 1003 | 48 They are Hematopoietic stem cell.
I do not want to do GeneChip, only RT-PCR.
Can I use normal RNA kit to extract RNA from PFA-fixed cells? |
|
n**********1
发帖数: 251 | 49 请问是否有办法可以分别抽提胞浆和胞核的RNA？
由于实验需要分别检测胞浆和胞核中某个基因的表达，不知道是否有办法，或者kit可
以分别抽提胞浆和胞核的RNA，多谢。 |
|
f*********r
发帖数: 1233 | 50 假设你说的是小鼠。一般是取胫骨和股骨。一共4根骨头的骨髓绝对不少。每根骨头提
出10^7细胞没有问题。应该比1盘10cm的细胞多。每次取完，放在pbs里冲散，计数看一
下。不应该象你说的产量那么少。可惜离普大太远，不然可以表演给你看。
用trizol提rna，不用过液氮。只要homogenize了，trizol可以有效保护rna。4度冰箱
里放个把星期没问题。
是不是因为液氮这样的低温影响了trizol，我就没有经验了。 |
|
