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Biology版 - 如何证明一个蛋白是RNA Binding Protein
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从total RNA里面提取mRNA-求建议mRNA降解是从5'端开始还是3’端开始还是从中间开始的?
18S rRNA做内参的问题如何在没有抗体的情况下快速CONFIRM CRISPR KO
求问RNA immunoprecipiation(RIP)问题Re: about RNA
有人用NEBnext的kit做RNA-seq library吗求mRNA isolation kit
cas9/CRISPR 请教YFP为啥是green的
如何比较快速简单地把cDNA给做成dsDNA?问一下版上的Two-photon高手
问个RNAseq检测mRNA变化的问题。Cre小鼠GFP fusion蛋白表达困扰
求高手指点Cas9 directed Knock-In如何寻找转录因子?
相关话题的讨论汇总
话题: rna话题: protein话题: 蛋白话题: binding话题: 结合
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r**a
发帖数: 121
1
我们研究的一个蛋白,有一个HTH motif
以前的文章证明它可以in vitro结合DNA,但是10多年来一直没有后续进展
我们觉得,它可能实际上结合的是RNA
它在几个大规模RNA binding protein的筛选里被发现
同时有报道它可以和ribosome结合,可能通过RNA方式
现在,我们不知道它倒底结合什么RNA
有什么好的方法可以证明这个是RNA结合蛋白呢?
a********k
发帖数: 2273
2
yeast three hybrid

我们研究的一个蛋白,有一个HTH motif
以前的文章证明它可以in vitro结合DNA,但是10多年来一直没有后续进展
我们觉得,它可能实际上结合的是RNA
它在几个大规模RNA binding protein的筛选里被发现
同时有报道它可以和ribosome结合,可能通过RNA方式
现在,我们不知道它倒底结合什么RNA
有什么好的方法可以证明这个是RNA结合蛋白呢?

【在 r**a 的大作中提到】
: 我们研究的一个蛋白,有一个HTH motif
: 以前的文章证明它可以in vitro结合DNA,但是10多年来一直没有后续进展
: 我们觉得,它可能实际上结合的是RNA
: 它在几个大规模RNA binding protein的筛选里被发现
: 同时有报道它可以和ribosome结合,可能通过RNA方式
: 现在,我们不知道它倒底结合什么RNA
: 有什么好的方法可以证明这个是RNA结合蛋白呢?

r**a
发帖数: 121
3
这个可以在不知道结合什么RNA的情况下做?

【在 a********k 的大作中提到】
: yeast three hybrid
:
: 我们研究的一个蛋白,有一个HTH motif
: 以前的文章证明它可以in vitro结合DNA,但是10多年来一直没有后续进展
: 我们觉得,它可能实际上结合的是RNA
: 它在几个大规模RNA binding protein的筛选里被发现
: 同时有报道它可以和ribosome结合,可能通过RNA方式
: 现在,我们不知道它倒底结合什么RNA
: 有什么好的方法可以证明这个是RNA结合蛋白呢?

c*********r
发帖数: 1312
4
有好的抗体吗?
有的话能不能做CoIP,然后提取RNA做RNA-seq?
我的目标蛋白是localized,计划用类似的方法看这个complex里有没有localized RNA
。不知道是否可行。

【在 r**a 的大作中提到】
: 我们研究的一个蛋白,有一个HTH motif
: 以前的文章证明它可以in vitro结合DNA,但是10多年来一直没有后续进展
: 我们觉得,它可能实际上结合的是RNA
: 它在几个大规模RNA binding protein的筛选里被发现
: 同时有报道它可以和ribosome结合,可能通过RNA方式
: 现在,我们不知道它倒底结合什么RNA
: 有什么好的方法可以证明这个是RNA结合蛋白呢?

f*********9
发帖数: 258
5
用crispr/cas9
给这个蛋白的chr上加个tag然后做RNA IP
或者用biotin label 的oligo pulldown RNA 核protein 做protein seq
q******g
发帖数: 3858
6
我觉得这个方法可行。即使没有好抗体,连个HA,也可以看看是否有RNA结合。

RNA

【在 c*********r 的大作中提到】
: 有好的抗体吗?
: 有的话能不能做CoIP,然后提取RNA做RNA-seq?
: 我的目标蛋白是localized,计划用类似的方法看这个complex里有没有localized RNA
: 。不知道是否可行。

g**********a
发帖数: 17
7
这个方法可行不 CLIP (Cross-Linking and Immunoprecipitation) Identification
of RNAs Bound by a Specific Protein)
g********6
发帖数: 86
8
in vitro: 细菌表达GST融合蛋白,做GST pull down,可以用你提到的in vitro
transcribed rRNA,33P标记,完了之后做液闪。
in cell lines:转染HA/FLAG标记的蛋白表达质粒,做RNA immunoprecipitation,然
后做qPCR或RNA-seq。前面有人提到用CRISPR敲进标记,我觉得可能比较麻烦,不如用
质粒来的简单。当然最可信的方法还是用目的蛋白的抗体。
m*********D
发帖数: 1727
9
能不能in vitro translation合成S-35标记你的蛋白,然后把这个蛋白和你感兴趣的细
胞里分离纯化出来total RNA混合(注意buffer,pH),上Electrophoretic mobility
shift assay(EMSA)gel,比较有RNA和没有RNA的lane上条带的变化。还可以再有一个蛋
白-RNA-RNase的lane作比较。应该可以证明你的蛋白是不是和RNA结合。
r**a
发帖数: 121
10
谢谢各位的建议。
目前,我们还不准备做RNA-seq,觉得耗费是不是太大了
我们第一步,只是想证明这个是RNA binding的蛋白
我们目前有一个myc tag的蛋白,在转在果蝇里面(我们是做果蝇的),而且是
functional的,所以可以用这个抗体,但是在果蝇里面好象没有好的办法标记RNA (我
不知道能不能尝试,用oligo dT的beads,pulldown,能不能拉下我的蛋白?)
还有一个,我们已经在那个HTH motif做了点突变,有几个突变体有很好的现象,
所以我们还想进一步证明,这个作用是通过这个区域进行的。
所以,只要是一个体外的实验,证明上面两点就可以了。
midwestPhD大哥的方法不错,就是我个人对这个EMSA有点怵(听说挺麻烦的),以前硕
士的时候帮一个师兄一起搞过,没有做出来。

【在 m*********D 的大作中提到】
: 能不能in vitro translation合成S-35标记你的蛋白,然后把这个蛋白和你感兴趣的细
: 胞里分离纯化出来total RNA混合(注意buffer,pH),上Electrophoretic mobility
: shift assay(EMSA)gel,比较有RNA和没有RNA的lane上条带的变化。还可以再有一个蛋
: 白-RNA-RNase的lane作比较。应该可以证明你的蛋白是不是和RNA结合。

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问个RNAseq检测mRNA变化的问题。如何在没有抗体的情况下快速CONFIRM CRISPR KO
求高手指点Cas9 directed Knock-InRe: about RNA
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c*********r
发帖数: 1312
11
不做RNA-seq也可以用抗体pull down,提RNA,测一下有没有RNA;如果有的话,可以进
一步反转录合成cDNA、dsDNA做个library,然后克隆测序吧。我想。

【在 r**a 的大作中提到】
: 谢谢各位的建议。
: 目前,我们还不准备做RNA-seq,觉得耗费是不是太大了
: 我们第一步,只是想证明这个是RNA binding的蛋白
: 我们目前有一个myc tag的蛋白,在转在果蝇里面(我们是做果蝇的),而且是
: functional的,所以可以用这个抗体,但是在果蝇里面好象没有好的办法标记RNA (我
: 不知道能不能尝试,用oligo dT的beads,pulldown,能不能拉下我的蛋白?)
: 还有一个,我们已经在那个HTH motif做了点突变,有几个突变体有很好的现象,
: 所以我们还想进一步证明,这个作用是通过这个区域进行的。
: 所以,只要是一个体外的实验,证明上面两点就可以了。
: midwestPhD大哥的方法不错,就是我个人对这个EMSA有点怵(听说挺麻烦的),以前硕

r**a
发帖数: 121
12
如果这个方法可行,是最好的拉。
不过不好意思,对RNA,不适特别在行,
请问,这里怎么提取RNA,然后测RNA呢?
总不至于Nanodrop测浓度吧?
还有弄成cDNA之后,用随机引物合成dsDNA?
谢谢先了;-)

【在 c*********r 的大作中提到】
: 不做RNA-seq也可以用抗体pull down,提RNA,测一下有没有RNA;如果有的话,可以进
: 一步反转录合成cDNA、dsDNA做个library,然后克隆测序吧。我想。

c*********r
发帖数: 1312
13
我也不是内行。我觉得看你的input有多少。Input多的话,RNA怎么提都可以,用RNA
extraction kit,用trizol;RNA量大的话,用Nanodrop就可以检测吧。Input少的话,
可能需要比较小心,检测的话也需要用比较灵敏可靠的方法吧,这里我就不太了解了,
等版上其他高手解答吧。
Library构建的话有经典的方法吧,是不是最好用poly T primer + random primer来把
各种RNA都尽可能反转录?我没具体做过library,你再查查资料吧。我比较担心的是如
果rRNA比较多的话,最后挑克隆测序大部分都是rRNA。这样的话就最好不用random
primer了,或者通过其它方式deplete rRNA。其实rRNA多、input量大的话跑个RNA胶就
能检测RNA了。关键是你的蛋白可能会和哪些种类的RNA结合:rRNA, RNA with poly (A
) tail, RNA without poly (A) tail,甚至是小RNA。各种情况可能要分开讨论吧。
只是个人一点看法,仅供参考。

【在 r**a 的大作中提到】
: 如果这个方法可行,是最好的拉。
: 不过不好意思,对RNA,不适特别在行,
: 请问,这里怎么提取RNA,然后测RNA呢?
: 总不至于Nanodrop测浓度吧?
: 还有弄成cDNA之后,用随机引物合成dsDNA?
: 谢谢先了;-)

s******r
发帖数: 1245
14
clip肯定能pull到rna的,很多都是非特异,需要对比wt和rna binding domain
mutated两个样品间的区别,知道target的可以用realtime测,不知道target的只能上
array或者seq看

【在 r**a 的大作中提到】
: 如果这个方法可行,是最好的拉。
: 不过不好意思,对RNA,不适特别在行,
: 请问,这里怎么提取RNA,然后测RNA呢?
: 总不至于Nanodrop测浓度吧?
: 还有弄成cDNA之后,用随机引物合成dsDNA?
: 谢谢先了;-)

l**********1
发帖数: 5204
15
用GFP UV-corissing immunoprecipitated mRNAs assay
pls refer,
>
GFP-Based Method for Detection of mRNA-Protein Interactions
HeLa cells expressing N- or C-terminally EGFP/YFP-tagged proteins (Table S7)
were induced with tetracycline, irradiated with UV light, and lysed. GFP-
binding protein (GBP; GFP agarose trap, Chromotek)-immunoprecipitated mRNAs
were detected using an oligo(dT)25 probe fused to TRed dye (Sigma).
RNAs coimmunoprecipitated with GFP/YFP-tagged proteins were identified by
RNASeq. Detailed protocols can be found in the Supplemental Information.
cited from
Cell. (2012).149:1393-406.
Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22658674
PDf link:
HTTP double dot//rnajc.ucsf.edu/sites/rnajc.ucsf.edu/files/
CastelloArticlePlusSupplementalJune2012.pdf
or
Nat Protoc. (2013). 8: 491-500.
System-wide identification of RNA-binding proteins by interactome capture.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23411631
more alternative methods such as
Proc Natl Acad Sci U S A. (2013). 110: 5416-21.
RNA-protein analysis using a conditional CRISPR nuclease.
pls check
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?linkname=pubmed_pubmed_cited
then S(earch)I(t)(by)Y(ourself)..

【在 r**a 的大作中提到】
: 谢谢各位的建议。
: 目前,我们还不准备做RNA-seq,觉得耗费是不是太大了
: 我们第一步,只是想证明这个是RNA binding的蛋白
: 我们目前有一个myc tag的蛋白,在转在果蝇里面(我们是做果蝇的),而且是
: functional的,所以可以用这个抗体,但是在果蝇里面好象没有好的办法标记RNA (我
: 不知道能不能尝试,用oligo dT的beads,pulldown,能不能拉下我的蛋白?)
: 还有一个,我们已经在那个HTH motif做了点突变,有几个突变体有很好的现象,
: 所以我们还想进一步证明,这个作用是通过这个区域进行的。
: 所以,只要是一个体外的实验,证明上面两点就可以了。
: midwestPhD大哥的方法不错,就是我个人对这个EMSA有点怵(听说挺麻烦的),以前硕

j******n
发帖数: 941
16
RNA protection assay.
Crosslink, then RNase digest, then qPCR or other
h******h
发帖数: 1257
17
如果是yeast的话可以试试用tagged U1A去pulldown对应的mRNA然后看看你的蛋白在不
在mRNA上面
r**a
发帖数: 121
18
谢谢大家的建议。
和老板讨论了一下,他建议简单的先来,
就IP拉下RNA,然后用random primer,看能不能弄下条带了
试试看吧,不知道行不行!

【在 r**a 的大作中提到】
: 我们研究的一个蛋白,有一个HTH motif
: 以前的文章证明它可以in vitro结合DNA,但是10多年来一直没有后续进展
: 我们觉得,它可能实际上结合的是RNA
: 它在几个大规模RNA binding protein的筛选里被发现
: 同时有报道它可以和ribosome结合,可能通过RNA方式
: 现在,我们不知道它倒底结合什么RNA
: 有什么好的方法可以证明这个是RNA结合蛋白呢?

b******k
发帖数: 1874
19

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~请问这个筛选是怎么做的呢?
我感觉RBP是一个比较难做的领域,可能是一个金矿。

【在 r**a 的大作中提到】
: 我们研究的一个蛋白,有一个HTH motif
: 以前的文章证明它可以in vitro结合DNA,但是10多年来一直没有后续进展
: 我们觉得,它可能实际上结合的是RNA
: 它在几个大规模RNA binding protein的筛选里被发现
: 同时有报道它可以和ribosome结合,可能通过RNA方式
: 现在,我们不知道它倒底结合什么RNA
: 有什么好的方法可以证明这个是RNA结合蛋白呢?

r**a
发帖数: 121
20
lotkaeuler11的回复里,好几个文章都是讲这个的
我就是主要看的其中的一个cell文章

【在 b******k 的大作中提到】
:
: ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~请问这个筛选是怎么做的呢?
: 我感觉RBP是一个比较难做的领域,可能是一个金矿。

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求mRNA isolation kitCre小鼠GFP fusion蛋白表达困扰
YFP为啥是green的如何寻找转录因子?
问一下版上的Two-photon高手一个基因的transcript水平高,一定是转录活跃造成的吗?
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a***e
发帖数: 1010
21
crosslink,
IP,
+/- RNaseA/T1
purify nucleic acid
p32 labeling,
PAGE
v********a
发帖数: 646
22

good idea

【在 f*********9 的大作中提到】
: 用crispr/cas9
: 给这个蛋白的chr上加个tag然后做RNA IP
: 或者用biotin label 的oligo pulldown RNA 核protein 做protein seq

a****n
发帖数: 3082
23
用小角中子散射可行

【在 r**a 的大作中提到】
: 我们研究的一个蛋白,有一个HTH motif
: 以前的文章证明它可以in vitro结合DNA,但是10多年来一直没有后续进展
: 我们觉得,它可能实际上结合的是RNA
: 它在几个大规模RNA binding protein的筛选里被发现
: 同时有报道它可以和ribosome结合,可能通过RNA方式
: 现在,我们不知道它倒底结合什么RNA
: 有什么好的方法可以证明这个是RNA结合蛋白呢?

m***i
发帖数: 166
24
这个是最靠谱的。要跑SDS-PAGE,再转上nitrocellulose,然后曝光用phosphoimager
看。用高浓度RNase,这样如果看到的条带是和protein MW差不多就是了。negative
ctrl用IgG和没有UV x-link
1 (共1页)
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如何寻找转录因子?cas9/CRISPR 请教
一个基因的transcript水平高,一定是转录活跃造成的吗?如何比较快速简单地把cDNA给做成dsDNA?
请问GFP抗体能识别别的荧光蛋白吗?问个RNAseq检测mRNA变化的问题。
谁给讲一下荧光信号吧求高手指点Cas9 directed Knock-In
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