n********k
发帖数: 2818 | 1 do u want mRNA only or you want rRNA depletion, for rRNA depletion, rRNA-
zero from epicentre is the way to go...with one around, I got virtually no
rRNA as determined by agilent Chip...based on the kit, the starting RNA is about 5ug and ends up with 150-
400ng RNA. So about 3-8%...that's what I got for all my 8 samples...
total |
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l**********1
发帖数: 5204 | 2 alternatively you can try Oligotex-dt30 mRNA purification kit for total RNA
sample:
Manual book:
//catalog.takara-bio.co.jp/PDFFiles/NTrap%20mRNA_j.pdf
Vender link:
//www.mn-net.com/Products/DNAandRNApurification/RNA/NucleoTrapmRNA/tabid/1328/language/en-
US/Default.aspx
Reference:
please go to
PubMed link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18678863
T Yabu - 2008 JBC
31 Oct 2008 – In zebrafish embryonic cells, the endogenous SMase enzyme was
.... using the Oligotex-dt30 mRNA purification kit (Tak... 阅读全帖 |
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S*M
发帖数: 10832 | 3 一个癌症cell line
我想知道各种gene，non-coding RNA的expression level
不需要具体的sequence
是不是RNA-seq随便做啊？
得多少钱啊？
我不是真的要做，就是想搞清楚可行不
thanks |
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a***r
发帖数: 58 | 4 忽然冒出来的问题,为什么DNA没有象RNA一样选择uracil? 如果DNA 中的T大量的被
uracil替换而又不被修复的话,会有什么后果? 又或者RNA也使用T 可以不? |
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s******y
发帖数: 28562 | 5 你是说，如果RNA 用了T的话，由于结合过于紧密，反而会在某些特定场合导致RNA结构
过于稳定而影响function? 这个倒是很有意思的一个说法。 |
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C*****h
发帖数: 926 | 6 液氮加Trizol，RNA不会降解。
但是，你的RNA很可能是在剥的10分钟，降解了。
所以，你现在就是要尽量想办法，缩短“剥”的这一个过程。 |
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b*******n
发帖数: 8420 | 7 prostate这个组织确实很tricky
因为这玩意本身有很多腺体，在解剖的时候会释放出大量的各种RNase protease之类的
东西，所以只用TRIZOL的话RNA会降解
所以要么就用RNA later，可以保证不降解
要么就是液氮低温处理再加TRIZOL
你最好问问专门做prostate的人要他们的protocol看看，可以少走些弯路 |
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m******p
发帖数: 67 | 8 i have a sample, either total RNA or cDNA. anyone has a method to determine
whether it is RNA or cDNA?
Thanks |
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a*****i
发帖数: 679 | 9 我们一直用4%多聚甲醛固定，没有问题。切片过程如果保持比较干净的环境，没有RNA
free的影响不大。杂交之前的步骤肯定是要RNA free的。 |
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l******u
发帖数: 936 | 10 but how can you know whether the RNA has been degredated, how did you do
the RNA quality control from a single cell (one cell). |
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l******u
发帖数: 936 | 11 even original RNA quality is not so good, you could amplify the RNA, and get
certain amount of cDNA. In Agilent bioanalyzer, it is hard to say whether
the cDNA quality is good or not. If you compare some samples (for example
Mut vs Ctr, disease vs healthy), more or less you could get NGS result, but
how good of the data quality, it really hard to say. |
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e***o
发帖数: 344 | 14 想要筛选RNA互做蛋白，不知道yeat three hybrid 和RNA pull-down 那个更靠谱一些
。有做过这方面实验的大侠们吗？
Merry Xmas! |
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s*********y
发帖数: 579 | 15 We usually cut a piece of tissue and put in RNAlater. This way we can
isolate RNA later.
This time I got some tissue from other lab. They just keep tissue in -80
degree.Has anybody extract RNA from them? How is the quality? |
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i*****g
发帖数: 11893 | 16 你的RNA extract里面DNA去干净没有？
另外，RNA的事情和蛋白可以差很远 |
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i*****i
发帖数: 154 | 17 我们想做的是LncRNA的差异表达，本来打算用array来做的，比起传统的array，LncRNA
的array还是很贵的。但是我们觉得RNA-Seq能够得到更多的信息，而且作Multiplexing
的话，一个lane可以做4-6个sample。
不过刚入门，或者说还没有入门，没有经验。
我们用Core的service。
他们提供两种flow cell，一种是8个lane的Hi-Seq2000，每条lane能得到180M的reads/
Clusters。如果是pair end的话，当然还是180M的clusters，但是reads就加倍了。另
外一种是HiSeq2500，2-lane的flow cell，rapid mode，大概能出300M的reads/
clusters, PE cluster不变，reads加倍，当然价钱也比较贵，但是turnaround time很
快。
就传统的8个lane的Hi-Seq2000而言，一个sample大概能拿到40-50M的数据（cluster）
，pair end测序的话，大概80M左右（两次测序算两个reads，但是他们来源
于一个clu... 阅读全帖 |
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m*p
发帖数: 226 | 18 Hi my friends, I did a bunch RNA Seq and got the data (relative expression
level, splicing isoform, etc). Can you send me (j*****[email protected]) the
links of free software to analyze RNA seq data or microarray data? Thanks,
Map |
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z********4
发帖数: 701 | 19 小弟诚心向版上做RNA的大牛请教：
在哪些情况下（研究领域或者应用中）RNA的3'末端精确性至关重要，多一个nt都不行？
我只知道tRNA。请大家不吝指点，非常感谢！ |
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s****a
发帖数: 55 | 20 多谢回复。我最近在做一个小RNA时发现3end有很多polymorphysim不知道是发转时造成
的，还是真实有意义的data。以前不做RNA,不知道这种 polymorphysim的意义何在。增
加target? 这么多polymorphysim那岂不是有点乱？ |
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z********4
发帖数: 701 | 21 小RNA末端一般都是加工过的吧？你是怎么检测到的？sequencing？3'末端对你研究的
小RNA功能重要么 |
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u*******1
发帖数: 4 | 22 准备做small RNA seq。
看了NEB的protocol， 跟illumina的protocol，有些不一样。比如1.）连5‘adapter之
前，就先让RT primer 跟3’adapter hybrid。2.）推荐XPbeads 纯化而不是PAGE跑胶
纯化。
个人感觉NEB的方法更好一些，RT primer 跟3’adapter hybrid看起来更合理。
XPbeads 纯化操作起来也更容易一些。
现在手里有illumina的kit，不知道可不可以用NEB的方法做。
本人菜鸟，请班上有经验的大侠给的建议！
不甚感激！ |
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C***Y
发帖数: 61 | 23 It is necessary to perform PAGE purification for small RNA sequencing
library construction. Based on my experience, Ampure XP beads purification
is not sufficient enough to separate 160 bp from 120 bp. |
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i*S
发帖数: 175 | 24 RNA --- in situ hybridization
Protein --- 免疫荧光
除了这两个，就没什么可以用的了吗？
现在我是做免疫荧光发现某个protein存在于某神经组织的一种细胞里，但是以前都认
为是只存在于这个组织另一种细胞里的，老板不放心想确认一下.这两种细胞也是离得很
近的，很难分离以后单独检测RNA/protein什么的。我觉得是不是做个in situ看看mRNA
以外就没什么办法了啊？ |
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l******u
发帖数: 936 | 25 骨髓细胞的RNA质量本来就不高，我们实验室从老鼠骨髓抽的都不高，何况病人样本。
Qiagen只抽RNA的kit质量更好，买个RNeasy Micro Kit |
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n******e
发帖数: 110 | 26 在做肿瘤RNA测序相关的研究，最近才开始注意到反转录酶的出错率，看了一些文献报
道，觉得这是个大的问题，尤其是在做一些de novo sequence 研究的时候。比如trans
-splicing 和alternative splicing，大多数开始的实验是通过cDNA来作研究的。对于
一两个的transcript到是可以用传统的方法来验证通过cDNA sequence 的结果，可是对
于高通量的测序结果，好像没有人去一个个都验证吧。下面是两篇由反转录酶引起假阳
性的例子。
有没有同学对这方面熟悉的，比如反转录酶的错误率，怎么控制RNA sequence的准确，
希望可以讨论讨论。
1. Houseley, J. and D. Tollervey, Apparent non-canonical trans-splicing is
generated by reverse transcriptase in vitro. PLoS One. 5(8): p. e12271.
2. Zeng, X.C. and S.X. Wang, Evidence that BmTXK beta-B... 阅读全帖 |
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l******u
发帖数: 936 | 27 RT 实验影响转录水平的研究不仅仅在RNA Seq 中存在， 普通表达谱microArray中也有
，最好的方法是直接读RNA测序，还有的就是现在做转录的很好的工具 nanostring，
但是nanostring 不能做到 de novo sequencing 的很多东西。
trans
is |
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D**R
发帖数: 371 | 28 最近做了一批RNA Extraciton，用NanoDrop测时碰到一个问题，大部分的RNA value都
在范围之内5-25 ng/ul，可是有两三个的samples值很高，超过200ng/ul，但是qPCR却
一点amplification也没有，那那个OD260 peak到底是什么东西呢？我们的是人的
sample，那些有bacterial contamination？怎么可以把它们去掉呢？多谢多谢 |
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p**********t
发帖数: 2636 | 29 RNA 用qubit，nanodrop很不准确的，乱七八糟的contamination都会影响读数
你是说purify Rna之后的，没有，我们做完qPCR之后倒是跑过胶，跟别的正常的比没有
出来amplified的band，另外也差不多啊，你有什么建议呢？ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 30 用bioanalyzer跑一下RNA看看有没有降解。另外楼上说了，Qubit测浓度比Nanodrop可
靠。不过如果RNA没有降解，纯度也够高的话，nanodrop应该够用的。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 31 DNase I不会degrade RNA。你有RNA degradation是因为你的sample有RNase污染。
DNase I处理之后跑胶纯化就不用管heat inactivation了，就是麻烦点。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 32 我用Invitrogen的Qubit Assay测RNA浓度
nanodrop测浓度是分不清DNA RNA的 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 33 Pls do below Gel electrophoresis to
check for Genomic DNA contamination and RNA decay.
Optical density is used to assay the RNA yield and to check for
contamination by salt, solvent, protein, etc.
figure attached,
from
HTTP double dot //www.flychip.org.uk/protocols/gene_expression/rna_qc.pdf |
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n********e
发帖数: 1630 | 34 你做qPCR 要不要把RNA 反转录到cDNA。 你用什么RT？ 可能RT效率很低，RNA浓度低了
就无法产生cDNA。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 35 看了半天没有一个人说
RNA 和DNA降解后，变成短链甚至核苷酸，260都是升高的，260：280甚至会高于2
如果你根据这个读书觉得质量“超级好”，那你就要小心了
简单的用DEPC H20 做胶和buffer，洗干净tank跑一下就知道了，大概1k多以下应该有
两条带，分别对应两条核糖体RNA，没有的话就可以歇了 |
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b*****y
发帖数: 196 | 36 RNA-Seq这种转录组分析能否对比两个不同物种的基因表达水平？比如两个低等生物，
种属关系很近，但是一种有特殊器官，另一种没有，是否可以通过RNA-Seq对比分析，
进而鉴定出特异的基因？有没有类似的文章？谢谢大牛。 |
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m********8
发帖数: 157 | 37 RNA-seq can be useful as long as you have proper experiment design... In
your case, if you know conditions for that special structure function and
then you may get some clues about the genetic basis of it combing d'état
fom RNA-seq and comparative DNA seq. good luck! |
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d****i
发帖数: 2346 | 38 做了一个实验，用药处理细胞后取mRNA，发现mRNA增加非常多。然后又做了一次试验取
protein，看看这个基因的蛋白 western水平有没有增加，结果发现蛋白水平没有增加
。因为一般来说mRNA增加很多protein也会相应增加。不知道是那里做错了，为了同时
做mRNA和protein，打算用dadish养细胞并加药处理，收集细胞后一分为二，分别做RNA
和protein。
打算这样做：收集细胞的时候先把细胞刮下来，离心后重悬，然后一分为二，分别加入
RNA和protein的lysis buffer。
问题：我还想用这些protein检测post-translational modifications，比如磷酸化乙
酰化什么的。
在收集细胞过程中，这些post-translational modifications可能改变，能不能用PBS
把medium洗掉之后用4%的formaldehyde固定一下细胞，保留所有post-translational
modifications？
请大家指点一下。谢谢！ |
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T****i
发帖数: 15191 | 39 有用Trizol先提RNA再提蛋白的流程，你应该能google 到。不过不知道对于
posttranslational modifications怎么样。对于磷酸化，有一大堆phosphatase
inhibitors，最便宜的应该是Sodium Vanadate。不过一般几个同时用，才能抑制多种
phosphatase。
RNA
PBS |
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d****i
发帖数: 2346 | 40
非常感谢！你说的那个先RNA后protein的方法我是知道的，但是我不想因为RNA提取过
程中给protein引入其他的杂质，比如残留的酚氯仿什么的。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 41 Pls check,
i) Trapnell C et al., (2012).
Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments
with TopHat and Cufflinks.
Nat Protoc 7: 562–578.
ii) Li H et al., (2009).
The sequence alignment/Map format and SAMtools.
Bioinformatics 25: 2078–2079.
plus
Weikard R et al., (2013).
Identification of novel transcripts and noncoding RNAs in bovine skin by
deep next generation sequencing.
BMC Genomics. 14: 789. [Epub ahead of print]
>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24225384
c... 阅读全帖 |
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a******k
发帖数: 1190 | 42 I've seen that paper. My impression is that Cufflink remains the only one
that can do reference-based transcript assembly. Please correct me if I am
wrong.
Some tools like Augustus are originally designed to identify transcript(gene
models) without RNA-seq data. They now can use RNA-seq data, but
interesting is that the performance does not increase a lot with more
information. Most of the other tools do de-novo transcript reconstruction.
SLIDE seems another unique tool that do transcript abunda... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 43 RE:
>is that Cufflink remains the only one
Yes, if by overlap graph mode, Cufflinks is the only one,
but now we have 'Traph' which by splicing graph mode,
it was used minimum-cost network flows princeple..
details pls check,
Tomescu AI et al., (2013).
A Novel Combinatorial Method for Estimating
Transcript Expression with RNA-Seq:
Bounding the Number of Paths
Abstract. RNA-Seq technology o ers new high-throughput ways for transcript
identi cation and quanti cation based on short reads, and has ... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 44 Sorry,
now pls check this one,
one historic review about almost soft what used in RNA-seq de novo assembly
task..
its slide PPTX file link, (n.b. already converted to PDF format)
HTTP double dot//www.cs.helsinki.fi/u/tomescu/traph/TKRM-HITSEQ.pdf
or attached Table here,
>
发信人: aablackk (black), 信区: Biology
标 题: Re: 如何处理RNA-Seq
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Jan 5 02:03:36 2014, 美东)
omitted
Most of the other tools do de-novo transcript reconstruction. SLIDE seems
another unique tool that do transcript abu... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 45 RNA-seq SGS (Next Generation Sequencing 2.0) might be already older protocol
, (n.b. likes celluar Phone 3G service)
pls refer TGS(Next Generation Sequencing 3.0)and RNA-seq SGS hybrid protocol
new paper (n.b. likes cell phone 3.5 G service )
Au KF at al., (2013).
Characterization of the human ESC transcriptome by hybrid sequencing.
Proc Natl Acad Sci U S A. 110: E4821-30.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24282307 |
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f*********9
发帖数: 258 | 46 用crispr／cas9
给这个蛋白的chr上加个tag然后做RNA IP
或者用biotin label 的oligo pulldown RNA 核protein 做protein seq |
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q******g
发帖数: 3858 | 47 我觉得这个方法可行。即使没有好抗体，连个HA，也可以看看是否有RNA结合。
RNA |
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g********6
发帖数: 86 | 48 in vitro: 细菌表达GST融合蛋白，做GST pull down，可以用你提到的in vitro
transcribed rRNA，33P标记，完了之后做液闪。
in cell lines：转染HA/FLAG标记的蛋白表达质粒，做RNA immunoprecipitation，然
后做qPCR或RNA-seq。前面有人提到用CRISPR敲进标记，我觉得可能比较麻烦，不如用
质粒来的简单。当然最可信的方法还是用目的蛋白的抗体。 |
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s******r
发帖数: 1245 | 49 clip肯定能pull到rna的，很多都是非特异，需要对比wt和rna binding domain
mutated两个样品间的区别，知道target的可以用realtime测，不知道target的只能上
array或者seq看 |
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s**e
发帖数: 1523 | 50 我做得时候是调的。如果你做得样品浓度一直比较稳定，cDNA都能出来，那么时间长了
也可以省略（虽然我个人不推荐）。我那时候不光测RNA浓度调成一致，还要跑个快胶
看看提出来了没有。迅速的做rtPCR有时候是怕RNA降解。 |
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