m*********D
发帖数: 1727 | 1 这个可能得问有机专业的。我瞎说：
感觉是酸性条件下，酚苯环上的OH基团保持原状，在碱性条件下是O-。也就是说酸性条
件下，酚作溶剂的极性没有碱性条件下强。在有机分子里，氧是极性的标志，DNA和RNA
的差别是一个O的多少，也就是RNA极性大。另外，相对DNA的碱基C, RNA的U上面少一个
甲基，也有利RNA溶于极性溶剂。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 2 用GFP UV-corissing immunoprecipitated mRNAs assay
pls refer,
>
GFP-Based Method for Detection of mRNA-Protein Interactions
HeLa cells expressing N- or C-terminally EGFP/YFP-tagged proteins (Table S7)
were induced with tetracycline, irradiated with UV light, and lysed. GFP-
binding protein (GBP; GFP agarose trap, Chromotek)-immunoprecipitated mRNAs
were detected using an oligo(dT)25 probe fused to TRed dye (Sigma).
RNAs coimmunoprecipitated with GFP/YFP-tagged proteins were identified by
RNASeq. D... 阅读全帖 |
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S**********g
发帖数: 109 | 3 提RNA--反转录PCR--realtime PCR，在这其中，提完RNA之后，要不要测RNA浓度吗？在
做反转录PCR之前，要把所有RNA样品调正为同一浓度吗？
有人认为不用，因为在做realtime PCR的时候，有内参作对比，所以不用，但有的人还
是说要调正浓度，到底应不应该调正呐？
谢谢 |
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z****u
发帖数: 1007 | 4 关于是否sample 混杂. 我的理解是，因为我在寻找一个在这个population里高表达的
gene, 希望在不同的老鼠里都同样的高表达，所以把很多sample pool together应该有
好处。500个cell/mouse实在太少了 。
我们的core说mRNA量在20ng以上，按照mRNA占总RNA 5%左右的比例计算，预测需要1ug
的总RNA.
对single cell sequencing或者RNA amplification 实在有些没信心，能推荐个啥公司
做这玩意的吗。我们的core 反正做不了。 |
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p********l
发帖数: 233 | 5 Our lab is working on RNA-seq with small RNA input. Honestly, if you use
available commercial kit, you should be fine with 100-200ng RNA. The core
usually request more just for backup. |
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s********8
发帖数: 619 | 6 有人有经验吗?
手上的课题需要从极少量的FACSed细胞中提取RNA做RNAseq.现在一次sorting只能拿到
差不多3000个细胞,运气好的话应该一次可以拿到6000个细胞.
本来打算直接sort到Trizol里面冻起来,这样多sort几次,攒在一起提RNA.可是FACS
facility又不让我用Trizol,所以现在是sort到 RNaqueous micro kit 的lysis buffer
里.提完了RNA一测,几乎啥也测不出来,因为大概也只有十几个ng的样子.
所以我是不是应该考虑用commercial kit来做个amplification?求大牛推荐kit或者好
的方法! |
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c*********r
发帖数: 1312 | 7 理论上够了，关键看你用什么试剂盒来做library。和有经验的sequencing facility交
流交流。
测低浓度RNA不要用nanodrop，用Qubit HS(High Sensitivity)或者bioanalyzer。
我去年暑假做的，500 ng可以作常规的RNA-seq，而且当时担心Ribo-Zero那一步会不会
有很多损失。实际上现在需要的RNA量可以比这个低很多。
单细胞的测序也开始流行，就是成本高。。。
buffer |
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J**a
发帖数: 215 | 8 最近才刚开始做RIP，用抗体从cell lysate里面pull down一个mRNA binding protein
以及和它有interaction的RNA，请问这样isolate出来的RNA里面一般rRNA和mRNA的
ratio大概是怎样的？和cell lysate的total input RNA相比，RIP出来的RNA product
里面是不是supposed应该很大幅度的enrich mRNA？
版上知道的大侠帮帮忙了，谢谢！ |
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v********a
发帖数: 646 | 9 说来惭愧
做分子生物学好些年了，我觉得从转染的细胞上提取RNA一直提不好。按照标准的
Trizol protocol，但是我的问题：
1、操作非常慢，2个24孔的板子，我差不多要半天才能提到粗制的RNA (异丙醇沉淀得
到的）
2、RNA提取的质量不好，260/280低于1.9， 260/230低于1.5
3、由此得到的qPCR效果，也不是很好。同个处理的3个孔之间，variation很大，那个
误差线可以让人上吊。
4、找不到一个好的方法，去掉基因组。
哪位能提供一个reliable的, DNA free的RNA提取Protocol？ （不要说kit：因为50个
样品的kit，只能做一次实验）
有文献支持最好。
谢谢！ |
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v********a
发帖数: 646 | 10
The RNeasy Plus Mini Kit purifies up to 100 μg total RNA (>200 nt) from a
single extraction with efficient gDNA removal.
RNAs over 200nt are eligible for RNA-seq? |
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a******n
发帖数: 45 | 11 如果RNA量大的话， trizol 》DNase I treatment 》Qiagen RNeasy Mini Kit
purify。 量小的话，RNeasy plus micro kit或者Life Arcturus Picopure RNA
isolation Kit， on column DNase digestion。不要直接用trizol提的RNA做library
，纯度不够。 |
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b******s
发帖数: 1089 | 12 想弄出一些植物原生质体提取RNA做转录组分析。
原生质体很难弄，所以我们可能要把材料分成几批来做，想每次搞出一些就放到RNA提
取液里冻到-80，最后合并在一起再提取。请问这样是否可行，RNA在这个过程中是否会
降解？
我觉得植物原生质体跟动物细胞差不多了，但是据说RNA在提原生质体过程中就有降解
，想在这请教一下有经验的人。谢谢！ |
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v********a
发帖数: 646 | 13 想做RNA/Protein的共定位
用ISH检测RNA,其中有一步是蛋白酶消化；
用IHC定位蛋白质, 其中有一步可能用到RNAse A消化；
请问哪位可以提供一个reliable的protocol，可以兼容RNA FISH/Protein IHC, 以此可
以看到RNA-Protein的co－locatization？
谢谢！ |
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v********a
发帖数: 646 | 14 想做RNA/Protein的共定位
用ISH检测RNA,其中有一步是蛋白酶消化；
用IHC定位蛋白质, 其中有一步可能用到RNAse A消化；
请问哪位可以提供一个reliable的protocol，可以兼容RNA FISH/Protein IHC, 以此可
以看到RNA-Protein的co－locatization？
谢谢！ |
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l*****7
发帖数: 8463 | 15 根据目前已知的,CRISPR和ngAGO的作用机制有相似之处。
它们的相似之处在于:
作用位点都是 DNA－RNA hybrid （双链）
这样的话，从理论上讲，无论用DNA 或RNA 做引物，应该都有作用。
用RNA做引物切DNA；用DNA做引物切RNA。
可能有遗漏和忽略之处，还请指正。 |
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l**k
发帖数: 45267 | 16 FDA说要解决新冠检测试剂盒不够的承诺不知道兑现与否，现在看来兑现了也不能实现应
检尽检啊。 这东西早就该自己做了吧，中国做了800万份检测可不是靠买Qiagen的RNA
kit
https://www.the-scientist.com/news-opinion/rna-extraction-kits-for-covid-19-
tests-are-in-short-supply-in-us-67250
An RNA extraction kit that is in high demand for COVID-19 testing is on
backorder, Germany-based diagnostics and biological supplies company Qiagen
tells Politico. |
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a**********3
发帖数: 86 | 17 如题，我们在合成cDNA时通常需要按照所测算到的RNA浓度来换算所需RNA的量，在我们
最近的一次实验中，PCR产物电泳显示了实验组比对照组的条带的强度要强至少2倍，但
是实时PCR所算出来的表达强度仅仅为对照组的1.3倍，并不是很高。在考虑产生这个差
异的可能原因时，我们考虑到是否是由于我们仅仅将RNA的换算后的所需量的体积单位
精确到小数点后一位而不是两位导致的？希望有经验的各位老师指导。 |
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k**e
发帖数: 2728 | 18 en?
非极性溶剂是destablize nucleotides的啊。我没有做过跟RNA相关的实验，但是RNA是
应该避免碱性条件，至于用水还是用乙醇，我认为用水好点。因为水是极性的分子，可以
稳定RNA的结构
还有nucleotides之类的东西，以及NTP、dNTPs啦等溶液的储存，应该是根据自己每次实验
大概需要的量，aliquot到separate tubes里头。每次实验只拿出一个tube来解冻，争取1
次到2次的实验就能把那个tube的样品用完。 |
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w****e
发帖数: 14 | 19 It depends on how you want to use those RNAs.
I think if you try to do any reaction with them, it is not good to have a
trace
of ethanol. but if you want to extract mRNAs or do electrophoresis, it may not
matter.
BTW, have you tried to heat it at 65 degree for 10 minutes? it should help
dissolving RNAs.
The trizol protocol recommends to air dry RNAs for about 10 minutes, which
usually can results a little ethanol in the tube. |
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d*****r
发帖数: 2583 | 20 ☆─────────────────────────────────────☆
xlow (low) 于 (Mon Feb 23 00:52:33 2009) 提到:
如果想lively地trace一些有某个RNA特异表达的细胞，有没有什么比较成熟的方法？
我看到有人利用一段RNA 通过二级结构和一个蛋白的特异结合，然后通过fusion了GFP
的这个蛋白来marK RNA的位置， 但是背景很高，在整个细胞的level上估计根本看不清
楚。。。
不知道各位见过／听说过别的方法啊。。谢了。。。
☆─────────────────────────────────────☆
sunnyday (艳阳天) 于 (Mon Feb 23 01:09:18 2009) 提到:
就是这个方法。在细胞水平上要看到没有问题。
GFP
☆─────────────────────────────────────☆
ahche (啊且) 于 (Mon Feb 23 01:27:43 2009) 提到:
MS2 or lambda-N are still the most po |
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n********k
发帖数: 2818 | 21 first, i could be ignorant but as far as I know RNA-seq is not there yet...
still in research phase...and all the so called RNA-Seq in seminars etc are
indeed cDNA-seq...nonetheless, RNA-seq is going to be there hopefully soon
and shall much advantage over cDNA-seq...
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f******g
发帖数: 1003 | 22 I am working on extracting total RNA from few PFA-fixed cells (about 200
cells).
Now we have MagMAX™-96 Total RNA Isolation Kit (Cat:AM1830). This kit
is for RNA extraction from normal cells.
Did anyone have experience on it?
Thank you in advance, |
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w******e
发帖数: 1187 | 23 常用的kit对small size RNA/DNA太差，不知道做aptamer/siRNA/micro RNA的铜锈们
都用什么kit做RNA extraction？还是基本都trizol＋phenol＋ethanol，不用
column？ |
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y******y
发帖数: 107 | 24 说明书似乎没有介绍可以提取bacteria 的 total RNA，但是可以提取yeast的total
RNA，不知能不能用来提取bacteria 的 total RNA？谢谢。 |
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w******e
发帖数: 1187 | 25 想test tissue RNA和2'-F RNA在plasma里的stability, 准备做qRT-PCR
side by side.
请推荐housekeeping RNA的primers。多谢！ |
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O*********e
发帖数: 79 | 26 It was ethanol precipitation, 100% first and then wash with 70%
I've been dealing with RNA for quite some time, never had this problem
before.
The RNA was from peritoneal macrophages. I was warned before about the tough
RNA pellets, and just realized it was such a pain ... |
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w******e
发帖数: 1187 | 27 RNA有OD260，NTP也有OD260，那RNA被degrade的过程OD260会有改变吗？
如果没有的话，有什么其他好办法能不用run gel就看出RNA的integrity呢？
多谢！ |
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w******a
发帖数: 1527 | 28 Check this one:
Reagents
* TRIzol from Invitrogen #15596-108.
* Mini RNeasy plus kit from Qiagen #74134.
* Phase lock gel from Eppendorf #2302830.
* Keep TRIzol at 4C.
* Use RNase-free tubes and tips for all steps.
* Prepare 70% ethanol using DEPC-H2O and keep it at -20C.
RNeasy plus kit contains a genomic DNA elimination column. It can replace
the DNase I digestion step of regular RNeasy kit.
1. Add 1.2 ml TRIzol reagent to cells/tissues (5~10X 106 cells/ml or 50~100
mg ... 阅读全帖 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 29 if you outsource the job, you only need submit total RNA.
bioinfo can be done with a charge too. good thing about RNA-seq is that you
only need sample RNA and money to get a lot of data. |
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x*****o
发帖数: 441 | 30 和很多做RNA NMR的谈过,镁离子浓度过高会使谱图看起来很差,所以他们使用不超过5mM
. 要是想要稳定RNA结构,在buffer里面至少需要10mM.
你是做RNA NMR的?你平时用什么浓度? |
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x*****o
发帖数: 441 | 31 Mg 有效的中和RNA backbone 的负电荷,可以稳定二,三级结构. Na或者K没有Mg有效,
一般认为稳定的是RNA的二级结构.如果在没有镁的情况下,大量的单价离子 (1M)可以减
少 non-specific binding,稳定特定的conformation. 但是不知道NMR是不是不能用大
量的单价离子.
我们实验室以前也用hairpin(虽然不是核磁)hairpin ribozyme, 但是觉得mg 在10mM
的时候效果最好.
我以前有朋友做RNA NMR, 也是hairpin,不过他们的stem是GC rich的,比较稳定. |
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F*****e
发帖数: 182 | 32 准备从wildtype和mutant的老鼠里取mouse tissue，提取total RNA后做mRNA seqencing。
在犹豫是用Trizol还是Qiagen RNeasy Protect Mini Kit，因为需要先取胚胎，然后
PCR鉴定genotype，之后才能决定需要做哪个，因此最好能将tissue保存一段时间。
Qiagen的kit里面有一个RNAlater RNA Stabilization Reagent，号称tissue放在里面
可以4度保存4周而RNA不被降解，真的这么安全么？有没有用过这个kit的朋友。
另外mRNA sequencing给的结果到底有多可信？定量分析怎么样？多谢。 |
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c********d
发帖数: 75 | 33 RLT里头记得要有fresh 2-ME，sorting过程中RLT用4度水浴,sorting完了如果不是马上提
rna，转移过程中管子要放dry ice上然后-80度保存。提rna时快速室温水浴解冻，注意
观察冰块一
旦快融尽，迅速转移到冰上操作。提出的rna取两三个微升做质检，剩下的就赶紧冻起
来，运输过程也
都保证冰冻状态。总之尽量保证全过程的低温和快速。
用RNAlater对低温的要求不高，就是多一步离心，会有一些细胞的损失。两万细胞剩下
的应该也够做
一个chip了。 |
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s****u
发帖数: 497 | 34 最近提RNA，每4小时一次共要48小时。我白天提白天的样品，晚上2个样品的就让实验
室一个同学（他是夜猫子，喜欢夜里工作）帮我离心冻到-80。但是已经连续2次了，他
收的样品提出的RNA全降解了（当然不知道原因，不能说他作的不好）。我白天作的都
很好。现在为了不浪费时间，我准备48小时在实验室作完整个试验。以前我答应过她如
果我能发表加他的名字，如果是这样还要加他吗？另外我不知道是不是解冻的问题，
RNA怎么就降解了呢？我提出工作48小时，我老板不同意，怕我累着。我老板建议说要
不，就把夜里的样品放在冰上第2天提，我知道肯定不行，但我不知道理由。大家帮我
解释一下。谢谢 |
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l********s
发帖数: 70 | 35 最近做RNA从plate中提取，发现RNA测试有机溶剂那个参数很低，0.3-0.6 。 其实最后
我尽量把乙醇抽吸干净。我怀疑是不是DEPC水有问题，因为我统一吧RNA dilute 到
100ng/ul 做反转，发现dilute后，那个比值更低了。。。
当然Nanodrop 的control 用的是DEPC，这个不会搞错。。
不知道为啥，怎么提高这个比值？ 另外这个如果低多大程度影响反转？ |
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t*d
发帖数: 1290 | 36 看了几篇文献，没搞懂他们的technical replicates 是怎么定义的。
引用比较多的那篇“Marioni JC, Mason CE, Mane SM, Stephens M, Gilad Y: RNA-
seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene
expression arrays. Genome Res 2008, 18:1509-1517.”他们的technical
replicates 是把构建好的短片段放在不同lanes，然后比较不同lane 出来的读数。
因为RNA-seq 很大一部分工作在如何构建最后测序的短片段库，而且这个建库的过程相
当繁琐，可能会带来很多的variation。我觉得更严格的technical replicates 应该从
RNA 抽提开始。比如，一份细胞分两管，分别进行建库和测序，然后再比较读数，看看
varation 有多大。
那位同学能不能推荐几篇比较这种更严格的 technical replicates 的文章？多谢了先！ |
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e***o
发帖数: 344 | 37 polycistronic expression因该还是一段RNA吧？ 我想弄两段RNA。
2段RNA加起来超过5kb了，AAV应该不好弄了。 |
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a***l
发帖数: 32 | 38 发现一个蛋白调控一片noncoding RNA区域，怎样先map这个noncoding RNA的大小啊，
这一片有几百K,难道设计一堆引物么，或者做很多克隆做RNA探针杂交？。。。。。。
。。
求教啊 |
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j*p
发帖数: 411 | 39 There has been quite a few RNAseq data released recently, many of them been
uploaded to UCSC genome browser as tracks (human and mouse). You may want to
try:
(1) go to that loci of the noncoding RNA you are interested.
(2) check RNAseq data and computational predicted tracks and see whether the
RNA is expressed, how many exons, what is the predicted splicing structure
etc.
(3) then RACE or you might want to test some functional study before RACE.
Personally, I doubted a noncoding RNA covers ~100... 阅读全帖 |
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x*****o
发帖数: 441 | 40 定了一个RNA样品,让公司给deprotect 和提纯了.因为lab manager 和公司沟通的问题,
RNA样品寄到学校的时候,学校圣诞新年假期不开门. 今天收到的时候才发现这个样品
一周前就收到了,估计在fedex搁了一周.
RNA样品一直是干燥的,但是已经是deprotected 的了. 室温在fedex放了一周,还能用吗
? 主要的问题除了降解还有别的吗? 是不是跑个PAGE胶看着没问题就成了?
大家给看看吧. 这些工作不上心的美国人简直雷死我了,跟她说一定要让公司新年后再
寄出来.最后..... |
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D*****l
发帖数: 554 | 41 I use RNA easy kit for RNA isolation and quality is always good.
Have you used RNA later for your mouse tissues? |
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w***y
发帖数: 493 | 42 我现在正在尝试从zebrafish embryo的total RNA里面提取mRNA， 用的是invitrogen的
Dynabeads和他们的mRNA purification kit。 按照他们的protocol做完后跑胶发现里
面还是有挺多rRNA。上网搜了一下发现有的人建议连续做2次protocol里说的
purification。 请问大家有什么建议么？
我试了一下发现第1次纯化后获得了大概3.8%的total RNA。第二次以后有1.5%的total
RNA。我不太确定这样连续2次purification会不会损失太多mRNA。 |
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v****e
发帖数: 131 | 43 最近用老鼠组织提RNA，准备做microarray，可是RNA降解了。损失了`20个老鼠，非常
不幸。
dissect tissue，每个老鼠take 10分钟，因为比较难剥。是不是这个原因？放在RNA
LATER里比较难剥，因为变硬了。
然后就直接把tiisue放在液氮里了。抽的时候，放在trizol里。用匀浆器打散，抽提。
最后用RNAEASY纯化，
大家觉得有什么问题？有人和我说用液氮磨碎组织再加trizol，有用吗？谢谢 |
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s******r
发帖数: 2876 | 44 请问普通的福尔马林固定的标本，可以用来做RNA in situ hybridization吗？
切片的过程中也没有RNA free，
杂交的时候应该尽量RNA free吧，这个技术是不是容易掌握，
如果有好的protocol，欢迎分享，或者推荐一些简单易学的protocol，
实验室完全没有这方面的经验，周围也找不到专家,
抗体又不好使，没法IHC. |
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s******r
发帖数: 2876 | 45 老板想要从laser capture的少量细胞里提RNA，做array。
请教什么kit现在比较适合小量提取RNA，产率怎么样，
做array的话，还要不要纯化mRNA，哪家的kit比较好用，
array之前，RNA需要扩增吧，有什么好的kit或者protocol推荐一下。 |
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e**e
发帖数: 166 | 47 问题请教
我提取的RNA 用DNAase处理以后 在２８s １８s上面还有两条暗带。(见附件) 应该不
是DNA污染。 降解的RNA也不应该在上面。 哪位RNA大拿可以解释一下？ |
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f*******a
发帖数: 671 | 48 希望有这方面经验的人介绍一下各自用的产品。
我做很小量细胞（2000个）的RNA-seq看differential expression.
以前我都用Qiagen,但是发现Nugen Prelude™ Direct Lysis Module这个产品很
方便,所以希望有经验的人给点意见。
另外，Nugen Ovation RNA-Seq kit VII这个KIT有人用过吗，怎么样？
还有哪家RNA扩增的Kit比较好？谢谢！ |
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n**8
发帖数: 221 | 49 你用什么方法检测mRNA水平的? qRT-PCR 还是northern。
如果是我，我会去检测是否存在anti-sense RNA（noncoding RNA）。
会不会只是anti-sense RNA水平上升？ |
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a*******g
发帖数: 33 | 50 大家好，我在做老鼠关节炎模型，需要提取RNA,但是不理想。有没人做过这个可以分析
下经验的？谢谢我先把踝关节剪下 （长1cm左右），然后液氮冷冻，放－80保存。裂解
是用Roche的Megbead，RNA提取是按照Qiagen的纤维组织RNA提取Kit。没有做DNase消化
。用Agilent2100检测，很多样品只有很粗的一条带，在18s band附近，估计是genomic
DNA? |
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