J**a
发帖数: 215 | 1 最近才刚开始做RIP，用抗体从cell lysate里面pull down一个mRNA binding protein
以及和它有interaction的RNA，请问这样isolate出来的RNA里面一般rRNA和mRNA的
ratio大概是怎样的？和cell lysate的total input RNA相比，RIP出来的RNA product
里面是不是supposed应该很大幅度的enrich mRNA？
版上知道的大侠帮帮忙了，谢谢！ |
w*e
发帖数: 740 | 2 rRNA和mRNA的ratio取决于你的抗体，
RIP出来的RNA应该比input RNA 富集很多倍。 |
s******r
发帖数: 1245 | 3 得看啥protein和target mRNA
用rRNA做normalize的话IP前后target mRNA/rRNA ratio差几百几千倍都有
protein
product
【在 J**a 的大作中提到】
: 最近才刚开始做RIP，用抗体从cell lysate里面pull down一个mRNA binding protein
: 以及和它有interaction的RNA，请问这样isolate出来的RNA里面一般rRNA和mRNA的
: ratio大概是怎样的？和cell lysate的total input RNA相比，RIP出来的RNA product
: 里面是不是supposed应该很大幅度的enrich mRNA？
: 版上知道的大侠帮帮忙了，谢谢！
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J**a
发帖数: 215 | 4 谢谢了！我做了TapeStation RNA Tape, 所以看的不是一个target mRNA transcript，
而是所有的total RNA profile。IP前后的RNA在TapeStation跑出来都是rRNA占绝大多
数，18S和28S的2个peak都很高。不知道TapeStation对mRNA的sensitivity怎么样，但
是我assume 18S，28S两个峰底下那些background就是mRNA，看上去这些mRNA并没有明
显的相对于18S,28S的峰有enrich。。。不知道这个正常么？
【在 s******r 的大作中提到】
: 得看啥protein和target mRNA
: 用rRNA做normalize的话IP前后target mRNA/rRNA ratio差几百几千倍都有
:
: protein
: product
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J**a
发帖数: 215 | 5 多谢！请问一般用什么方法比较reliable的测出rRNA/mRNA ratio? 我做了TapeStation
RNA Tape, IP前后的RNA在TapeStation跑出来的trace都是rRNA占绝大多数，18S和28S
的2个peak IP前后都很高。不知道TapeStation对mRNA的sensitivity怎么样，但是我
assume 18S，28S两个峰底下那些看似background的就是mRNA，但是看上去这些mRNA并
没有明显的相对于18S,28S的峰有enrich。。。不知道这个正常么？
【在 w*e 的大作中提到】
: rRNA和mRNA的ratio取决于你的抗体，
: RIP出来的RNA应该比input RNA 富集很多倍。
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s******r
发帖数: 1245 | 6 光跑胶看不了enrichment，mRNA到处都是，也看不出组分，rRNA永远是大头
有已知target的做qPCR，没有的做seq，array
【在 J**a 的大作中提到】
: 谢谢了！我做了TapeStation RNA Tape, 所以看的不是一个target mRNA transcript，
: 而是所有的total RNA profile。IP前后的RNA在TapeStation跑出来都是rRNA占绝大多
: 数，18S和28S的2个peak都很高。不知道TapeStation对mRNA的sensitivity怎么样，但
: 是我assume 18S，28S两个峰底下那些background就是mRNA，看上去这些mRNA并没有明
: 显的相对于18S,28S的峰有enrich。。。不知道这个正常么？
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g********6
发帖数: 86 | 7 可以deplete rRNA后做NGS。不知道你用什么beads做IP，magnetic beads有很高的
background binding。
TapeStation
28S
【在 J**a 的大作中提到】
: 多谢！请问一般用什么方法比较reliable的测出rRNA/mRNA ratio? 我做了TapeStation
: RNA Tape, IP前后的RNA在TapeStation跑出来的trace都是rRNA占绝大多数，18S和28S
: 的2个peak IP前后都很高。不知道TapeStation对mRNA的sensitivity怎么样，但是我
: assume 18S，28S两个峰底下那些看似background的就是mRNA，但是看上去这些mRNA并
: 没有明显的相对于18S,28S的峰有enrich。。。不知道这个正常么？
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J**a
发帖数: 215 | 8 多谢建议，我是用protein G/Ab conjugated dynabeads，不过我的negative control
用了一个irrelavent的抗体（不和任何已知蛋白有相互作用）。做出来的RIP结果rna浓
度比真正的ip实验低很多。请问有啥降低background的方法么，或者啥beads更好？
【在 g********6 的大作中提到】
: 可以deplete rRNA后做NGS。不知道你用什么beads做IP，magnetic beads有很高的
: background binding。
:
: TapeStation
: 28S
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X**********g
发帖数: 13 | 9 這個技術被認可嗎？
內行的說說，好像背景很高，看review說的。 |
