a***e
发帖数: 1010 | 1 (1)try p32 probe, that's better than dig-probe. try use StarFire kit to
increase the sensitivity of your probe (~10x).
(2)40-50 nt probe is more than enough. People can usually blot small RNAs
with 20-30 nt probes (after StarFire labeling)
(3) you can try Tagman-qPCR or splinted-ligation assay, or LNA probe to do
northern blot
(4) deep sequencing w/ or w/o cloning |
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l**l
发帖数: 458 | 2 which one is better trizol, tri reagent, RNA bee?
Thank you! |
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f*********r
发帖数: 1233 | 3 具体情况具体分析。
是从组织提还是从细胞提
给个样品里大约含多少rna
用途是什么：逆转录pcr，real-time pcr 还是superarray等
经费是否宽裕
对时间有无要求（耗费几小时甚至超过一天的方法是否能接受） |
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H***e
发帖数: 223 | 4 我没有用过trizol，用过后两种，感觉tri-reagent比RNA bee效果好很多。 |
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l**l
发帖数: 458 | 5 RNA from lung tissue
for Real-time PCR
Thank you for the answer. |
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s******s
发帖数: 13035 | 6 用DNA probe还是RNA probe好，有什么好的paper(protocol)或者
衍生物推荐么？ 多谢 |
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n*****e
发帖数: 119 | 7 用biotin标记的dna就好了。我前一阵子试过，不过没有继续。据我了解dynal beads还
行，但是他们的人没有太关注rna。还有个macs什么的公司，有专门的kit。不知道效果
如何。 |
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l**********a
发帖数: 23 | 8 H.pylori 好难养啊。我用blood agar获取足够多的细胞，然后从琼脂上的菌落直接提
取，但不知是
琼脂干扰还是羊血作怪，TriZol提取的RNA用Qbit 检测不到。
请仙人指路啊！多谢了！ |
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n*****e
发帖数: 119 | 9 问个问题楼主不要骂我……
你用trizol提取别的细胞的rna成功过吗 |
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a*******g
发帖数: 57 | 10 最近实验室在分离骨和骨髓的RNA,用的Trizol抽提法，产量好少好少，几乎没有。导师
整天让我去找别的方法，我都要崩溃了，根本找不到。有前辈做过这个不？ |
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a***e
发帖数: 1010 | 11 for RNA, the ratio is pretty good. You need run a gel to check the quality
of your sample even the ratio is perfect.
try to do most of the procedures on ice as much as you can. |
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v***a
发帖数: 1242 | 12 第一次做siRNA，想请教大家，用Trizol提取了RNA后，在进入RT-PCR之前有什么
注意事项吗？比如说像overexpression后要用Dnase I处理（感谢上次艳阳天mm的帮助
）。谢谢啊！ |
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v***a
发帖数: 1242 | 13 谢谢。以前只做从tissue中提取RNA，都没做过DNase I pre-treatment。出来的RT-PCR
的data倒是跟IB的吻合的。
不知道为什么in vitro了就不可以了呢？
还有，上次艳阳天mm说overexpression后做DNase I treatment是为了去除plasmid DNA
，想不通这个siRNA后是为了去除什么？谢谢。。。 |
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h****g
发帖数: 439 | 14 因为用Trizol或者说任何方法提RNA，都不能保证没有genomic DNA的contamination。所以要在RT前做一下 DNase I treatment
另外一个方法是，设计的引物要跨Intron，这样也可以避免genomic DNA 的contamination 的干扰.
PCR
DNA |
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c**n
发帖数: 73 | 15 The easier way is to design a pair of primers at exon junctions so that the
PCR reaction won't pick up anything from genomic DNA.
You can certainly do DNase I treatment but often you lose a lot of RNA
during this step. |
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y******y
发帖数: 107 | 16 是否可以用里面的提取yeast的方法提取bacteria的RNA？yeast的细胞壁和bacteria的
细胞壁应该是不是差不多？ |
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h******y
发帖数: 1374 | 17 用Typsin收细胞会影响后面用Kit提取total RNA么？
多谢 |
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e*r
发帖数: 103 | 18 如果解crosslink的话 RNA recovery 能达到做少呢？ |
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s******a
发帖数: 252 | 19 The fixing does affect RNA quality. It's doable, but you need try hard to
get good reproducibility. |
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e*r
发帖数: 103 | 20 Do you have some suggestions? I mean how to get good RNA. |
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l******u
发帖数: 936 | 21 Chip - Chip
是做DNA吧.
别人是要抽RNA做microarray, 肯定不行. |
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l******u
发帖数: 936 | 22 我LCM是切冰冻片.
就用100% EtOH 固定加脱水.
我用自己发明的方法通过参照点系列切片法定位细胞. 参照片子可以用任何方法染色,
目标片子不染色, 用100% EtOH 固定加脱水, 然后可以通过参照片上的定位找到目标
片上的细胞. 切下的细胞抽RNA,最高可以达到 9.0 以上的RIN. |
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e*r
发帖数: 103 | 23 每次能得到多少RNA呢？总量。 测的时候取多少呢？ |
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z*********o
发帖数: 5 | 24 今年申请，希望能够在non-coding RNA方向，想请教下这方向上处在上升期的教授，要
口碑好的教授，版上遭到没选好的导师的很多，不禁很紧张，先咨询下。谢谢！ |
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z*t
发帖数: 863 | 25 sigh...当时拿到offer时很想跟的一个教授。不过说不一定招人，只好放弃了。
他搞的RNA living imaging的工作还是相当promosing的 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 27 另外，如果你跑胶发现RNA还是有degradation的话，把isopropanol precipitation那
一步改成在冰上或者-20C下做好了，recovery的差别应该不会很显著的。 |
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C*****h
发帖数: 926 | 28 为什么不用Qiagen的RNeasy Kit?
过一下柱子，就是很纯的RNA。
不需要extraction，也不需要precipitation |
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f*********r
发帖数: 1233 | 29 对，我是今年才开始用的。因为以前一直用他们trizol，所以他们经常给我们发新产品
广告和免费试用小包装。试了一下，很好用。对于大规模处理样品，每次几十上百个样
品，这个试剂非常实用。好处如下：
1）一步完成，简便快捷。
2）对样品要求不高，适用范围广。rna质量有保证，比trizol只高不低。从大块组织到
少量细胞，都行。不象过柱，纯是纯，但是对浓度、液体量等都限制很严。
3）跟trizol兼容。
4）不贵
5）对实验人员的技巧要求甚低。 |
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j*****a
发帖数: 658 | 30 no, you still have to do precipitation to purify your RNA. |
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y****m
发帖数: 37 | 31 I recommend you to read Cold Spring Harb Protocol by Rio DC, Ares M Jr,
Hannon GJ, Nilsen TW.
1. less volumn required
2. after isopropanol precipitation, there are normally still lots of crap in
sample. I normally use water plus 0.25% SDS to dissolve pellet, then phenol
extract again, Ethenal precipitate the sample.
3. completely dried RNA is normally very hard to disovle, try to avoid that.
4. after sanp freeze, before thraw in trizol, you could grind it with liquid
N2 first, then disolve with |
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y***i
发帖数: 11639 | 32 在pubmed上只找到GeneID/Symbol之类的database，我现在需要每个human/mouse的
RNA的genome position 的database，大侠们是否知道哪里能下载？多谢！！ |
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n******7
发帖数: 12463 | 33 另外，我记得ncbi的ftp上有rna基因组坐标文件的，起码对refseq是这样 |
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S*****s
发帖数: 287 | 34 How did you precipitate RNA? If you use ethanol wash, did you get rid of
ethanol completely? I have tried both LiCl and Ethanol precipitation, then
resolve in either pure water or TE, no problem at all.
I
Thanks |
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w******e
发帖数: 1187 | 35 how did you isolate the RNA? trizol? did you use enough? is the pellet
oily?
I had similar problem before.
I
Thanks |
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a****k
发帖数: 1130 | 36 don't let the RNA pellet dry completely, it'll greatly decrease its
solubility
I
Thanks |
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O*********e
发帖数: 79 | 37 trizol
i think I used plenty
I can see the pellets floating in the TE, not oily though
I did the isolation with trizol samples from other cells, they were just
fine (nice pellets, dissolved easily in TE), so I'm thinking it's the
macrophage RNA that gives me trouble.
anybody on this board working with macrophages? |
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Y**I
发帖数: 444 | 38 vortex到手酸。
俺曾经vortex RNA pellet40分钟。。。最终被击破。
pellet
Qiagen |
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e*r
发帖数: 103 | 39 How long can RNA stay in Isopropanol for percipitation at -20?? |
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s**u
发帖数: 9035 | 40 3- 6 months is not a problem if your RNA is not too big. |
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y******e
发帖数: 277 | 41 手上有1000多个RNA-Seq reads，75bp，请问用啥软件把它们连起来？以前没有做过。
谢谢大家建议！=）
找到Cufflinks可以做，不过好像要Unix系统。请问有没有windows底下就能用的？多谢
啦！ |
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y******e
发帖数: 277 | 42 谢谢楼上两位大侠！ =）
不好意思，顶楼没有说清楚 >_<
是有2G多的reads，75bp each。没有参考的genes，不过是和果蝇相近的
fly。之前手动检查了一些同源基因，和果蝇的蛋白序列基本一样，cDNA有很多
synonymous substitutions。
我的想法是，先把所有的reads当成新的序列做assembly，之后再用blast against果蝇的基因做annotation。因为不太清楚直接用75bp RNA-seq reads match果蝇的transcripts 成不。。。
没有经验，多谢大家帮忙啦！ |
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w******e
发帖数: 1187 | 43 ding. do you know of any easy way to assess RNA integrin? thx |
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T**********t
发帖数: 1604 | 44 就是2100。我们实验室这台好久没人动了呢。:)
Bioanalyzer有很多应用啊。你们实验室开发microfluidics的，说不定可以借鉴一下，
或者在它的基础上开发点别的应用什么的，总之别跟他说你就是为了跑RNA看
degradation，不然他肯定让你自个儿跑个胶就完了。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 45 我手上现在没有RNA跑胶的照片
随便拿一个DNA跑胶的照片演示一下哈
Rf vs Intensity |
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C*******e
发帖数: 4348 | 46 提total RNA然后跑胶
发现预期的rRNA的条带全都比预期的要小
可是如果把marker那条lane去掉然后和别人paper上发表的图pattern基本是一模一样的
我觉得不是降解了
因为根本没有smear
而且降解不可能每条条带都变小一点然后整个pattern还是一样的
想问问看有没有人遇到过这种情况啊？
百思不得其解
而且我的marker跟DNA样一起跑的时候没有出过问题
size都是符合预期的 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 47 谢谢院长
我的确用的ds DNA marker
真是头晕了～！忘了ds，ss这一茬
RNA should run faster than the marker of the same sized DNA. |
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b****r
发帖数: 17995 | 48 我觉得也没什么好担心的
根据我自己的实验经验，我觉得大部分剪切型可能只是很痕量的表达，只是用PCR之类
极其敏感的方法能够鉴别出来，实际上是没有什么生物学意义的。RNA转录到翻译是一
个多级调控的过程，我觉得有很多残次品很正常，实际上还是要看那些最终变成了蛋白
质才是真正有意义的 |
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w******e
发帖数: 1187 | 49 想biotinylate aptamer做ELISA，之前用pierce的3' biotinylation kit,
一次只能label 50pmole。不知有没有kit能做large scale labeling。
我隐约记得有产品可以在RNA in vitro xcription的过程中把biotinylated
NTP加到sequence里，不知能不能做到只label 5'/3' end？otherwise
担心影响structure。
多谢！！ |
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b*********l
发帖数: 490 | 50 Anybody has experience with an RNA purification kit(Phenol and Chloriform
free)? I only found one from Norgen? Anybody knows if it's reliable?
Thanks a lot. |
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