G***G
发帖数: 16778 | 1 where can I download some RNA-seq fastq read files?
I am looking for a disease/cancer RNA-seq data to learn. |
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S*******e
发帖数: 94 | 2 很多long ncRNAs本身就比较短，表达量又低不容易检测。所以担心150bp paired end
建库的时候就是300bp左右了，容易把一些lncRNA给弄断了弄丢了。所以我的一个很个
人的建议是，直接100-nt SE就可以。重点是测得深一些，后续分析仔细点。
至于exon-exon junction，其实也无所谓了。 long ncRNA gene的本身是热点，但的
splice variant其实感觉上也不是一个特别好的热点。因为做这个的需要后续，这时
候麻烦事或者无效劳动量也挺多，个人意见了。
还有就是strand specific library之后用Cufflinks这一套去拼接lncRNA。这个如果是
intergenic的，那还好说。如果是Antisense，这个如上文有人提到，有"很多tricky的
地方"，从tophat这一步就开始了。
另外就是Poly-A selection或者Ribosomal RNA depletion。其实这两个技术回答的问题
有点不一样。 如果没有什么特异的考虑，那么我个人觉得Poly-A selection鉴定
lncRNAs
就... 阅读全帖 |
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m***T
发帖数: 11058 | 3 首先你得解释清楚你做RNA-Seq的目的是什么？一个样本需要多少reads？这些样本之间
是什么关系？
另外，core lab给的qc明显不够，有没有BioA的traces（包括RNA本身及library制成后
的），定量用的也是BioA还是qPCR等其它手段？Barcode就是如果一个样品所需要的能
量小，那一个run可以用加barcode的方式来区别不同样本，这样可以把多个样本pool在
一起做sequencing，成本会降低很多。
另外是在什么平台上做的？Illumina的还是其它的？ |
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x*****d
发帖数: 704 | 4 1.测序公司一般用Bioanalyzer测DNA的质量和浓度；所以会和Nanodrop有差别。
2.snap frozen的组织提RNA推荐RNA-Later ICE。 |
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l********e
发帖数: 415 | 5 这是个有意思的问题.
RNA反转录以后, 建library以前, 是必须超声打碎到150-300bp的小片段
所以,理论上说,部分降解的RNA是完全不影响测序的.
但是实际中应该有些细节要考虑,比如不能用oligo dt反转录或者polyA enrichment.
因为这样做出来的library会丢失所有没有polyA的片断.
市面上有用random primer建库的kit (比如Nugen). 因为是病人样本, 只要不是完全降
解, 值得尝试. |
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s******y
发帖数: 220 | 6 已经用nanodrop check 了， A260/280 是2.11， A260/230 是2.32
查了一下，A260/280对DNA是1.8， RNA是2.0， 是不是表示我的sample是OK呢？
有没有什么别的方法能快速验证一下，下游是要去做RNA seq的，谢谢！ |
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a*******g
发帖数: 33 | 7 大家好，我最近在做RNA seq。样品来自于激光剪切老鼠组织，RIN只有6左右，量也不
多，用了150ng total RNA.True seq V3建的library，qPCR显示library量够多。用
highseq 2500测了，在highthrough output条件下，4个样品在一个lane里，结果每个
样品只得到了10-15M 2X100bp，远低于预计的30M。core facility说他们也不知道原因
。请问大家有什么经验可以分享吗？另外，有没好的测序服务中心推荐呢？ |
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a*******g
发帖数: 33 | 8 rna定量是用qubit，library是用qpcr，他们说只能这样定量分析了.激光剪切的老鼠冰
冻组织提取Rna，RIN值大家一般能得到多少?有没有好的protocol可以分享 |
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L****T
发帖数: 169 | 9 bias会比较大，有时候这样做出来的结果会很难repeat。你可以尝试把RNA量多的那个
样品dilute到和RNA量少的那个样品同样浓度去做RT。 |
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w*e
发帖数: 740 | 10 请教一个这个方面的高手们，我想做一个过表达一个non coding RNA 的vector，我是
用只用cDNA序列呢，还是用整个genome里面的序列。以前都是做coding gene 的过表达
，只要cDNA就够了，不知道non coding RNA有没有什么特别要注意的？
谢谢 |
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i*********0
发帖数: 915 | 11 我的RNA seq是用Hiseq2000做的，single read mode，然后read的长度是50bp。
这样得到的data能做alternative splicing分析么？
如果不行，什么样参数的RNA-seq数据才能做一个比较可靠的分析？
谢谢！ |
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v**********t
发帖数: 9 | 12 从Dharmacon订的RNA，25mer, single-strand, HPLC purified, deprotected,
desalted.
拿到手后用DEPC water resuspend, 加到蛋白溶液后就把蛋白给沉淀了。先后订的三
批RNA全这样。
哪位知道这是怎么回事？ |
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D*a
发帖数: 6830 | 13 所以说你最好先找个分析数据的谈谈，看看他怎么说。这个你早不找晚也要找。RNA
seq主要就是依赖统计分析，去噪音，normalization，来出结果，你只有两个sample
（一个control一个treatment，或者一个population A一个population B），后续说不
定很难分析出啥来。
再说如果他专门做生物信息，说不定也处理过single cell数据，或者你这种数据，他
可以帮你推荐一下。我说single cell也不是说一定要去做single cell，就是觉得也不
至于稍微小一点量就没办法了，但是至于是不是像我想象的那样我也说不准。
我也是打算找marker，也是这个问题，怕拿到手的是一堆垃圾。你不先去谈谈，到最后
他也无力回天，然后很可能你直接对你的数据失去信心了。也许你谈了他说这样也可以
，那么你至少会知道这是正确的方法。
1ug |
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r*****q
发帖数: 216 | 14 设想的优势就是不用学任何programming，完全不用写 command-line code 就跟用
window desktop application 一样 鼠标点就行 就可以完成RNA的perprocessing分析
。 提供在windows 上run的solution。 使用业界标准的 processing tool
赞先只做 RNA-seq的 per-processing 包括 QA mapping 到output count data.
Tuxedo suite 用的时候也不是直接就能用啊。 你要学学怎么用。 再把相应的gtf 和
fa 啥的都找好。 然后你有multiple sample的时候 code 也得小改一下。当然 做完一
次之后 估计就不会再动了
请问您是专门做bioinformatics的吗？这个tool的target user 可能是lab里面的
postdoc 懂一点bioinformatics 但又需要开始分析这样的data |
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i*********0
发帖数: 915 | 15 我不是做植物的，最近看文章，看到这个RNA-directed DNA
methylation pathway，google search一下，这个东西只在植物里面有很多的报道，
review什么的都是植物方面的知识。
这个pathway在脊椎动物中不保守么？
是不是植物有什么特别的地方用到这个RNA-directed DNA
methylation？
懂行的同学来科普一下吧。
谢谢！ |
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D*a
发帖数: 6830 | 16 单细胞的都能做了，3000个不少了。kit不熟，直接问做rna seq的地方吧，如果他们不
知道，就问问他们跟谁合作做过这种然后再去问那个实验室。别自己闷头瞎搞。 |
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a*******g
发帖数: 33 | 17 样品在lysis buffer中可以冻起来，等收集几次之后pool在一起提取，不用扩增的话，
100ng就可以做sequence了。如果你需要测的样品比较多，嫌麻烦的话，10ng可以扩增
的。总体上，人们倾向不扩增。提起少量rna，有life tech的picropure和qigen的
rneasy micro kit,测浓度用life tech的quit,质量用aligent的picro chip。 |
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s********8
发帖数: 619 | 18 谢谢楼上各位的回复！我们的sequencing facility好像没有amplification的经验，他
们说要200ng RNA。我再去问问吧。
我也不太想扩增，尽量多做几次FACS，冻起来一起提吧。 |
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w*e
发帖数: 740 | 20 rRNA和mRNA的ratio取决于你的抗体，
RIP出来的RNA应该比input RNA 富集很多倍。 |
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J**a
发帖数: 215 | 21 多谢！请问一般用什么方法比较reliable的测出rRNA/mRNA ratio? 我做了TapeStation
RNA Tape, IP前后的RNA在TapeStation跑出来的trace都是rRNA占绝大多数，18S和28S
的2个peak IP前后都很高。不知道TapeStation对mRNA的sensitivity怎么样，但是我
assume 18S，28S两个峰底下那些看似background的就是mRNA，但是看上去这些mRNA并
没有明显的相对于18S,28S的峰有enrich。。。不知道这个正常么？ |
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b*****n
发帖数: 1841 | 23 提细胞的没问题，试提了组织的RNA，全降解了？大家有没有好用的protocol共享一下
？ |
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b*****n
发帖数: 1841 | 24 上网查了一些内容，发现相当一部分人推荐用DNase处理样品。
我想能否在Trizol抽提中加chloroform离心后的水相中加DNase，然后再加0.5ml
Trizol杀灭和去除DNase。
不确定水相中的成分，DNase的活性如何，再用少量Trizol抽提是否能把DNase去除干净。
或者用isopropanol沉淀后再加Dnase处理，再用Trizol去除DNase？这样沉淀的步骤对
RNA的损失比较大。
请大家发表一下意见。 |
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b*****n
发帖数: 1841 | 25 今天试了一下，这样处理genome DNA全部去除干净，除了RNA量有点损失外，其它一切
都好。 |
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B8
发帖数: 92 | 26 最近准备做rnaseq看基因表达的差别，
小鼠的组织样品。
请问各位哪个kit比较好用？
Qiagen的Rneasy kit如何？
提完rna是否还需要dnase处理？还是直接就可以做library了？
谢谢！ |
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n***w
发帖数: 2405 | 27 We work with tiny mouse tissues and we use RNeasy plus micro kit.
Just followed the instructions and worked fine for RNA-seq.
Qiagen has so many kits designed for so many tissue types. Check their
website. |
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B8
发帖数: 92 | 28 提完RNA后，做dnase treatment吗？
kit说一般不需要，
网上一些信息和前面的一个大侠都做的。
谢谢。 |
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i*********0
发帖数: 915 | 30 如果不是微量的组织的话，可以考虑用，Tri-reagent.
RNA 抽提完了以后，跑个 胶看看有没有明显的降解，如果没有的话，可以直接交给
facility了。 |
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e********c
发帖数: 30 | 31 RT。细胞是从流式sorting下来的，只有几千个细胞。请问用trizol直接提取RNA，然后
RT-qPCR检测特定基因的敲出效率，RNA够用吗？
有没有人这么做过呢？多谢！ |
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g*****n
发帖数: 241 | 32 最近刚了解到BioID和DamID，想问一下有没有什么类似的方法可以用来找RNA binding
protein的RNA targets的？（不包括CLIP）
谢谢 |
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v********a
发帖数: 646 | 33 别人做的RNA-Seq结果
如何从RNA-Seq结果差异显著的基因里面，快速全面地筛选出已经报道的、和某个疾病
相关的基因？
我知道做GO分析，可以挑出部分，但是也会遗漏很多。
求指点，谢谢 |
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b******s
发帖数: 1089 | 34 通常生物学重复很简单，就是独立取样，独立提取RNA，独立建库，独立测序。
但在实际中很多国内的公司都告诉我最好混样。
就是同一处理，同时提取几份RNA，再混起来成为一份样，然后再分开成几份分别建库
测序。
说这样也包含生物学重复，测序数据重复性也好，便于后面分析。大家怎么看？
实际发文章这样操作的多吗？ |
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发帖数: 1 | 35 大家好，
问一个和我上个帖子类似的一个问题。我在网上看到有些公司说，可以在RNA反转录
cDNA的时候，不用oligoDT或者hexamer, 而直接用gene-specific primer把一个基因给
扩出来。据他们说这个效率是最高的。我想问一下，如果用这个方法，是要用特殊的引
物嘛？如果用普通的DNA引物，它们能够anneal to RNA嘛？
谢谢 |
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D***e
发帖数: 44 | 36 手头的KO小鼠一直没做出来任何预设的结果。现在考虑把WT和KO去进行一下在做组织的
蛋白/基因表达分析，想看看可能的pathways和相关的蛋白表达是否有变化（如一些比
较关心的蛋白家族）。懂行的人说说这个思路靠谱不？靠谱的话，该用Microarray，
RNA-Seq还是DGE？已海归在国内，问了些公司，他们的销售都讲不清楚，有推荐
Microarray的，也有大力鼓吹RNA-Seq的。我以前没接触过这一块。其实我的诉求很简
单，就是做不下去了不想浪费，想扩大范围撞撞运气，但这个范围还是在我划定的一块
里面，而上述的测序之类看起来很庞杂的样子，不确定是否为我想要的。而且后期的数
据我不确定公司是否会分析到位。
如果有感兴趣的高手帮助我一起进行分析，可以给劳务费，也可以选择合作文章挂名。 |
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k*****2
发帖数: 135 | 37 不太了解DGE，但是RNA-seq比microarray要好。RNA-seq做起来也简单。 |
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l********e
发帖数: 415 | 38 这些都有直接或间接的问题。最好加上RNA gel shift
: IP，加或不加RNase，RT-qPCR
: RIP，WB
: FISH 抗体染色。
: 三个实验如果能共同证明一个问题，得证。
: [在 iseeyou1210 (iseeyou1210) 的大作中提到：]
: :目前猜测某蛋白是RNA结合蛋白，如何初步确定这个假设。
: :多谢！
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m****a
发帖数: 270 | 39 Cas9 引导物为RNA，为啥更容易结合DNA而不是RNA？ |
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x***a
发帖数: 6 | 40 如果只是分析细菌transcriptome，无需将两者的RNA分开，直接进行mapping即可。 |
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发帖数: 1 | 41 如果你只是需要提取细菌的RNA，你可以先把细菌从感染的人体组织里提取出来。如果
你用的组织是血液或者细胞，可以用专门的溶剂把血液和细胞破坏掉，我记得有一种含
有deoxycolate自己可以配,然后spin down wash几次。如果感染的组织是器官，可以先
用meganetic beats。 |
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q**********0
发帖数: 335 | 42 Sequencing facility requires separation of bacteria RNA. |
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g********e
发帖数: 65 | 43 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: aiyuaichou (sha he he), 信区: Biology
标 题: 怎么鉴别RNA/DNA?
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Jun 12 18:10:18 2009, 美东)
一样品要是标的不明确, 不知道是RNA还是DNA. 做什么实验可以确认? 多谢. |
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i******r
发帖数: 1415 | 44 组里人都不了解应该如何处理生物样品
我就是简单地把mica泡在RNA里面 然后拿出来吹干 然后做AFM 啥都没有。。。
我感觉我这个办法肯定不对
不知道对RNA DNA一类样品正确的处理方法应该是怎么样的
谢谢 |
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t****r
发帖数: 784 | 45 你必须想办法让RNA能够bind到mica的surface上面
一般可以用electrostatic force
取决于RNA的charge的状态 |
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y***e
发帖数: 6082 | 46 记得当年上课学过，貌似能很清晰的看到单链核酸
你必须想办法让RNA能够bind到mica的surface上面
一般可以用electrostatic force
取决于RNA的charge的状态 |
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z*****6
发帖数: 1486 | 47 RNA做成水溶液。。在mica 上放几分钟后，用Mg溶液洗。
但是这种结合力，我的经验告诉我还是不够高。。你可以看到RNA，但是未必是舒展状
态。。大多是团块。
我后来采用ATPES treatment.. 你去搜搜 Lyubchenko的文章。。有详细介绍。还有最
近进展。 |
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a***e
发帖数: 1010 | 49 http://www.sciencemag.org/content/vol322/issue5909/index.dtl
(1)Nascent RNA Sequencing Reveals Widespread Pausing and Divergent
Initiation at Human Promoters
Leighton J. Core, Joshua J. Waterfall, and John T. Lis
Science 19 December 2008: 1845-1848.
(2)Divergent Transcription from Active Promoters
Amy C. Seila, J. Mauro Calabrese, Stuart S. Levine, Gene W. Yeo, Peter B.
Rahl, Ryan A. Flynn, Richard A. Young, and Phillip A. Sharp
Science 19 December 2008: 1849-1851.
(3) RNA Exosome Depletion Reve |
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