发帖数: 1 | 1 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: love2000 (爱情), 信区: Biology
标 题: 长江学者论文被举报 武大:不存在学术造假行为
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jan 29 09:25:32 2018, 美东)
关于李红良团队被举报学术不端的调查意见
武汉大学学术委员会于2017年4月收到关于李红良团队在相关论文中存在学术不端
行为的匿名举报，依据《武汉大学学术不端行为查处细则》，核实了举报线索，启动了
学术调查。在此基础上，学校学术委员会责成武汉大学人民医院组织校内外专家进行调
查。
2017年12月18日，武汉大学人民医院组织包括3名校外院士组成的5人专家组对李
红良团队发表在《自然·医学》（Nature Medicine）的CFLAR和TIMBIM1两篇论文进行
了学术调查，专家组一致认为“不存在伪造科研数据的行为”。
针对2018年1月出现的新质疑，武汉大学学术委员会2018年1月26日召开主任委员
扩大会议，学术委员会主任（院士）、3名在校副主任（含1名同行院士）、1名校学术
委员会同行院士委员参加会议，另行邀请了校外7名同行... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 2 你太想当然了。
比方说我们做实验的人，每天会产生几百个文件，我们会把他们都放在同一个用时间做
标题的folder 里面，但是实验文件本身的名字很长而且相近。比方说
XXX-test-YYYrescue-GFP-1s-mCherry-500ms-63x-oil-09-12-14-001.tif
XXX-test-YYYrescue-GFP-1s-mCherry-500ms-63x-oil-09-12-14-002.tif
XXX-test-YYYrescue-GFP-1s-mCherry-500ms-63x-oil-09-12-14-003.tif
。。。
如果用folder法，那么每打开一个folder就只看那一天的文件。方便于我们进行对比和
分析。
如果用搜寻法，会导致一下出来几千个名字几乎一样的文件，但是很多是混合在不同日
期的，那么我们还必须对日期进行分类，会让我们多出很多本来没有必要的工作量。
而且，万一我去看学生的记录的话，现在的方式我不需要知道他们怎么对文件命名，我
只要进入他们的folder就知道他们哪天干了啥了。如果需要我搜寻，我还必须知道搜什
么才行。 |
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m*p
发帖数: 226 | 4 Embryonic hearts were co-transfected by RFP and GFP plasmids. Only 20% were
transfected. Boss argued that
all RFP and GFP should co-localized and I said it is impossible, only when
RFP and GFP plasmids are in the
same lipid vesicle and fused with the same cell, then they will colocalize.
She said she was one thousand
percent sure. I can not say more, as this might harm the relationship.
However, I would like to know the truth about this co-transfection. Thanks
for your imput. |
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s******a
发帖数: 44 | 5 First, you need film a gfp fusion protein that express constantly (gfp alone
should work here) to test your system and setting for photo bleaching.
GFP |
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t****p
发帖数: 1504 | 6 我主要是觉得做yeast等原始生物没有前途。worm/fly还可以再撑一些时间。
磷酸化的抗体不是弄GFP能搞定的。如果要整整个pathway，每个strain都弄个GFP
reporter也相当麻烦。
至于in vivo的实验，现在比较通行的做法是在cell line里面先搞清楚了，然后做个老
鼠啥的验证。这种情况下worm/fly的优势也比较有限。
发
GFP |
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c****y
发帖数: 14 | 7 请教各位大侠：
我想构建一个稳定细胞系，将质粒转染细胞并用抗生素筛选得到抗性12个细胞系，
但是Western blot检测不到蛋白表达。所以我又采用另一种策略构建，先将基因克隆到
Lentivirus vector上，用CMV promoter 启动目标基因表达，这个vector同时有EF1
promoter表达GFP, 重组质粒转染293T 细胞后制备lentivirus, 然后用Lentivirus感染
H1299细胞，再用GFP进行cell sorting得到稳定细胞系，在荧光显微镜下可以看到GFP
信号，所以这些细胞系应该是整合得有我的目标基因，但是，Western blot还是检测不
到蛋白表达。请问这是什么原因？另外，我瞬时转染这些质粒可以检测得到蛋白表达，
说明质粒正确。但为什么稳定细胞系检测不到蛋白表达呢？请问有什么可能的机制？谢
谢帮助！ |
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s******r
发帖数: 2876 | 8 也许你的CMV promoter被甲基化了，换个promoter试试。
请教各位大侠：
我想构建一个稳定细胞系，将质粒转染细胞并用抗生素筛选得到抗性12个细胞系，
但是Western blot检测不到蛋白表达。所以我又采用另一种策略构建，先将基因克隆到
Lentivirus vector上，用CMV promoter 启动目标基因表达，这个vector同时有EF1
promoter表达GFP, 重组质粒转染293T 细胞后制备lentivirus, 然后用Lentivirus感染
H1299细胞，再用GFP进行cell sorting得到稳定细胞系，在荧光显微镜下可以看到GFP
信号，所以这些细胞系应该是整合得有我的目标基因，但是，Western blot还是检测不
到蛋白表达。请问这是什么原因？另外，我瞬时转染这些质粒可以检测得到蛋白表达，
说明质粒正确。但为什么稳定细胞系检测不到蛋白表达呢？请问有什么可能的机制？谢
谢帮助！ |
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s******e
发帖数: 370 | 9 GFP有时由于某些原因（比如antigen retrieval）需要boost一下
以前用过invitrogen的一个有Alexa488conjugate的anti－GFP，还可以。如果GFP还是
出不来就再加一个二抗上去 |
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H*********8
发帖数: 323 | 10 我早有这个想法，但新加坡已经作得非常成熟，没啥新鲜的了。我就在新加坡搞过这个
研究。有以下一些难点：
1。个人搞得话，建立整套体系花钱不少。要有雄厚的资金。
2。市场前景不一定看好，风险比较大。GFP观赏鱼需要在荧光激发下才能发光，现在有
加强的GFP也可在日光下发光，但颜色没有想象的好看。转生长激素的鱼更没市场，你
想别人敢吃吗？
3。新加坡宫志远的转基因GFP鱼已经上市了，你再搞恐怕很难竞争过他。 |
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H*********8
发帖数: 323 | 11 我不是他实验室的,我在他隔壁实验室做过. 对他的LAB了解.整个生物系用的同一个斑
马鱼养殖FACILITY,宫的鱼最多.我看过他搞得转GFP鱼,在日光下就可以发红橙黄等光.
这种GFP是在水母中发现的,不是传统的GFP. |
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B******o
发帖数: 496 | 12 你问题里提到的24小时候之看到很少的细胞是GFP+。 这是infected的吧？
infected cells need at least 2 days to express the transgenes. 如果你仅仅在
24小时后就去check GFP，很难看到positive的细胞。应该多留一下，过一天再看，才
能知道你的virus titer到底如何。
如果2-3天后，infected的细胞里GFP+的还很少。那么说明你virus titer很低。这时候
你得去查是不是transfection效率不够，如果不是，那么说明你的packaging plasmid
或者packaging cells不好。 |
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Z**********g
发帖数: 222 | 13 一种可能是部分细胞被ko了,部分细胞没被ko,而你检测mRNA/蛋白/活性的时候,样品包
括了ko和没ko的细胞.另外一种情况是所有细胞只被ko了一个allele,另一个allele是wt
,也导致这种结果.所以要么该cre活性不够强,要么该cre在这群细胞中不均一表达.一个方
法是你可以把你的Cre;gene f/f的小鼠与GFP flox小鼠杂交,看看GFP的表达情况,同时
把GFP阳性的细胞FACS sorting出来,再检测mRNA/蛋白/活性. |
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d********0
发帖数: 318 | 14 我看到一篇文献，有几个转基因小鼠出现在文章中，该基因为A
1) A +/GFP
2) A GFP/-
3) A GFP/RA
4) A +/-
请问：
1）上述4个动物分别代表什么意思?
2）A-EGFP BAC转基因的小鼠，请问此类小鼠与一般的A-EGFP转基因小鼠，有何区别？ |
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V********n
发帖数: 305 | 15 感觉还是转染率的问题。镜下观察不准，一般会高估转染效率。可以转GFP过后，把细
胞弄下来跑flow。另，GFP一般是最容易转的，如果GFP转出来效率５０％，其他东西转的效率低个百分之１０－２０都很正常。 |
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y***i
发帖数: 11639 | 16 最好在同一层加大信号，比如用更亮的gfp，或者两个gfp甚至3个gfp连在一起，或者
用luciferase。加一层放大误差太大了。 |
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a***e
发帖数: 1010 | 17 In worms, there is an example.
When you express GFP in a worm and RNAi GFP in the P0 generation, you can
observe the silencing of GFP in the next 10-50 generations after the worms
are removed from RNAi. |
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g*********d
发帖数: 233 | 18 RNA干扰及其在动物繁殖中的应用
2009-12-28
RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通
过 RNA 调控基因表达的机制, 它是指在真核细胞中引入双链 RNA分子从而导致具有序
列同源性的基因产生特异性基因沉默 (gene silencing)的现象 。由于 RNA干扰可以阻
断特定的基因表达, 具有超越疫苗和抗病毒药物的诸多优点, 因此在阐述基因功能以及
蛋白质相互作用等方面, 表现出诱人的前景。近年来随着分子生物学的发展, RNAi 的
机制也不断被阐明, 同时国内外研究也证实 RNAi 技术可以为动物繁殖过程中所涉及的
基因功能提供一条新的思路, 这在科研和生产实践上都具有重要的意义。
1 RNAi的发现
Matzke 等于 1989 年报道了启动子介导的序列同源性基因共转染烟草可引起转
基因表达发生沉默。 1990 年, Napoli 和 Van der Krol 等为了让矮牵牛花的颜色更
加鲜艳, 把与紫色相关的查尔酮(chalcone)基因转染到牵牛花内, 结果意外发现, 植物
体的颜色... 阅读全帖 |
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l**********n
发帖数: 240 | 19 细胞表达GFP和shRNA，现在想用细胞免疫染色看靶蛋白水平是否下降了。
要用的二抗发光和GFP重叠。我怀疑这样行不通。
但老板告诉我，细胞固定透膜（用福尔马林和TRITON）过程中GFP被破坏了，不会影响
后面的immunumicroscropy 观察。
请问老板说的对吗？谢谢！ |
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S*****s
发帖数: 287 | 20 不好意思我的说法有点误导。我的 BAC 上面通过 Cre-LoxP 反应又连上去了一个单独
表达的 GFP 质粒。我要表达的基因用 BAC 上自带的 promoter 表达，GFP 用质粒上带
的 SV40 promoter 表达，两个不干扰，但是只要有 GFP 的细胞一定会有我的 BAC DNA
。如果你感兴趣的话可以看看这篇文章
Wade-Martins R, Smith ER, Tyminski E, Chiocca EA, Saeki Y (2001) An
infectious transfer and expression system for genomic DNA loci in human and
mouse cells. Nat Biotechnol 19:1067-1070.
Dr. Saeki 人很好，想用这个质粒的朋友可以直接和他联系。pEHHG 质粒拿回来之后只
需要用 NEB 买来的 Cre 做体外反应就可以连上 BAC。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 21 anti-GFP from Roche is very specific
For you protein, you may want to consider adding a Kozak sequence in front
of your fusion, if you are using the pEGFP-N vector.
The truth is in front of the free GFP in most cloning vector there is a
Kozak sequence and that's why the free GFP always has great expression, but
if you are using the pEGFP-N vector, because the MCS is in front of the
Kozak sequence, therefore your insert will have no Kozak sequence. |
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s*******e
发帖数: 1010 | 22 在你蛋白的C末端终止密码子之前加进两个限制性酶切位点，然后把你的补加的linker
和tag设计成引物。即使十六氨基酸加上十个His也就26×3=78个bp再加上两头的酶切位
点6×2=12和保护碱基四个，总共才不到100个碱基。设计两条长度60bp的引物在中间有
20bp的互补区域就正好能覆盖100个bp。放在一起退个火再延伸一个回合，把产物连到
你蛋白的C-末端就成了。
我觉得这个其实不是连多长的tail的问题，换tag可能更好。你可以连接一个GST或着
GFP到你蛋白的C末端，如果用GFP的话再把His连到GFP的C末端。这个融合蛋白如果能表
达就一定能亲和纯化。在两个蛋白之间加上一个蛋白酶切位点就有机会在纯化后切出你
的蛋白来。
另外，Hisx6已经不fashion了，要X8或者X10才能hold住场面！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 23 我们有一个蛋白，没有连GFP的时候很容易被一个抗体识别（肯定是特异信号，
因为有纯化蛋白，WT and KO control有非常好的识别），但是连上GFP之后就
没有识别了！换了另外一个抗体，也是一样结果！
大家遇到过这种情况么？我们的初步判断是这个GFP 因为有内部共价键，
所以不能被SDS完全变性，所以可能一大团东西摆在那里挡住了抗原位置。
这个该怎么处理？如果要做antigen retrieval怎么搞？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 24 不work.
即使是纯化出来的fusion protein，只要有那个GFP在, 针对原来的靶蛋白的抗体
就不work.但是又不能把GFP 切了，因为设计的时候没有考虑到这个因素，所以没有放
可以切的tag（教训啊！）
这个肯定是受到fusion GFP 的影响，因为我们有很多证据。
而且我们有特殊原因，还非得用原来设计的抗体不可，所以不能省了这一步。
除非我们一咬牙把辛苦设计好的蛋白以及前面几年做的工作全部扔了从头再设计，但是
这个是last resort, 所以千万不要劝我们想别的方法。呵呵。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 25 我们有一个蛋白，没有连GFP的时候很容易被一个抗体识别（肯定是特异信号，
因为有纯化蛋白，WT and KO control有非常好的识别），但是连上GFP之后就
没有识别了！换了另外一个抗体，也是一样结果！
大家遇到过这种情况么？我们的初步判断是这个GFP 因为有内部共价键，
所以不能被SDS完全变性，所以可能一大团东西摆在那里挡住了抗原位置。
这个该怎么处理？如果要做antigen retrieval怎么搞？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 26 不work.
即使是纯化出来的fusion protein，只要有那个GFP在, 针对原来的靶蛋白的抗体
就不work.但是又不能把GFP 切了，因为设计的时候没有考虑到这个因素，所以没有放
可以切的tag（教训啊！）
这个肯定是受到fusion GFP 的影响，因为我们有很多证据。
而且我们有特殊原因，还非得用原来设计的抗体不可，所以不能省了这一步。
除非我们一咬牙把辛苦设计好的蛋白以及前面几年做的工作全部扔了从头再设计，但是
这个是last resort, 所以千万不要劝我们想别的方法。呵呵。 |
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d*p
发帖数: 534 | 27 然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞，24小时候也
能看到至少80%的细胞表达GFP，说明包装过程中所用的包装质粒，试剂以及细胞应该没
有问题。
48-72小时候再看是否有GFP。GFP Debries, 会附在细胞上，看起来阳性，实际不是。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 28 你加点相应的抗生素，可能gfp就不会弱了吧
我没有S.aureus，但做得挺多的了，有gfp的也不少
想做的话，可以写信给别人要一个过来试试
将来你还可以做个混合的microfluid培养，一个带上红的rfp,一个是gfp,多好
了？ |
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b*******n
发帖数: 8420 | 29 从GFP到癌症治疗中间的空白太多，如果发现了GFP就忽悠说这是治疗癌症的希望，市场
是不会相信这种概念的。相反，如果某个蛋白的抑制剂在前期研究中被证实可以抑制肿
瘤生长，自然会有人来投资的。
而且我也没说要把发现GFP这种纯兴趣推动的科学推向市场。NIH和NSF之类的政府机构
应该保证这方面的研究，但是不需要铺开现在这么大的规模。现在NIH的问题就是规模
太大而且过于功利，做了太多市场应该做的事情。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 30 pll3.7通常是用来表达miRNA或者shRNA的。
最近想构建一个表达蛋白的载体，但是手上只有这套病毒系统。想问问：
1，有没有人用过这套系统表达蛋白？
2，mU6启动子应该是不能用吧，是不是要用CMV启动子，和GFP做融合表达？
3，我要表达的是一个转录因子，担心与GFP融合会影响其功能。考虑将 CMV+GFP 这段
用 CMV+外源基因+IRES+EGFP+SV40 polyA 替换掉，这样构建好的载体就有近10kb了，
会不会影响病毒包装效率？
另外再问一个我要过表达的是一个原癌基因，在安全性方面是不是要非常小心？ |
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r****r
发帖数: 36 | 31 昨天也刚好在看类似的paper 说说我的感觉
单分子成像技术是很不错 但是受限于dye的种类 能看的分子也受到很大的限制
不能像是抗体一样 想看什么就看什么 想看一的分子还得先找到可以用的dye才行
这在成像技术上或许是突破 但是要说应用..我想还差得很远
在有兴趣的protein上面接GFP 或许是一个方法 但不是每个蛋白质都可以随意的接GFP
比如某些膜蛋白你插一个GFP行为就天差地远了 |
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r****r
发帖数: 36 | 32 昨天也刚好在看类似的paper 说说我的感觉
单分子成像技术是很不错 但是受限于dye的种类 能看的分子也受到很大的限制
不能像是抗体一样 想看什么就看什么 想看一的分子还得先找到可以用的dye才行
这在成像技术上或许是突破 但是要说应用..我想还差得很远
在有兴趣的protein上面接GFP 或许是一个方法 但不是每个蛋白质都可以随意的接GFP
比如某些膜蛋白你插一个GFP行为就天差地远了 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 33 if by GFP not luciferase
you can try CAG (cytomegalovirus (CMV) early enhancer element and chicken
beta-actin) promoter
paper link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22378886
Mice strain link:
//jaxmice.jax.org/strain/016532.html
Description
The CAGs-rtTA3 transgene has a CAG (cytomegalovirus (CMV) early enhancer
element and chicken beta-actin) promoter driving widespread expression of
reverse tetracycline-controlled transactivator 3 (rtTA3). High rtTA3
expression is observed in most tissues examin... 阅读全帖 |
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f*****f
发帖数: 195 | 34 单独EGFP，用-20 C Methanol 固定时，发现很多细胞荧光变得极暗或消失（4%PFA正
常），是因为Methanol 消除了GFP的发光信号还是抽提了GFP蛋白？也就是说用GFP抗体
是否还能标记出来？ |
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k******0
发帖数: 1073 | 35 您的试验说明了：
1。 GFP抗体优于actin的抗体。同样的蛋白量，GFP抗体可以轻易监测到，而用actin抗
体比较费劲测定。
2。内源的actin表达量远高于GFP－actin的表达量。所以用actin抗体可以容易检测到
43kDa
的蛋白带，而较难检测到70kDa的带。
即使尝试其它办法，可能也是得出同样的结论。 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 36 你这个是生物男的自恨情绪作怪 period 就说GFP，没有分子生物学对GFP原始序列的改
造，造出更亮更稳定和有各种颜色的FP,GFP有那么实用么？ |
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b*****n
发帖数: 1841 | 37 用Lenti Virus感染细胞，第一二代效果非常好，过表达的达到几百倍，Knock down的
达到90%的效率。但是传了三四代之后，过表达的只有几倍了，而knock down的几乎没
有看到效果。
Lenti virus同时携带GFP，可以看到传过几代之后，GFP还在，但是亮度大大下降。
以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。
版上各位有否碰到类似的现象？如何解决？ |
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f*****f
发帖数: 195 | 38 目前正在做一个蛋白H。见附件GFP-H在293中表达：blot anti-GFP，H理论大小130kd，
GFP-H 150kd上面总有很深的背景。flag-H blot flag也类似：在130kd上有类似很深条
带。
蛋白可能有修饰么？泛素化？但好像一般泛素化检测需要转染Ub后才比较明显（不太清
楚），有类似例子么。
或是293 over-expression 有时会出现这种情况。
重复过多次不同的cell lysates，所以上面的背景应该不是实验操作原因。
谢谢 |
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h*****G
发帖数: 113 | 39 大家好，小弟最近构件质粒，插入GFP到一个基因的intron，利用endogenous的
promoter来表达GFP。基本的思路是Slice acceptor sequence-2A peptide-GFP, 因为
intron之前的exon没有刚好in frame, 所以需要在SA和2A之间加入几个碱基。现在的问
题不知道具体的SA 序列，在Addgene上看了几个plasmid，都没有把具体的序列位置给
标出来，所以也搞不清楚。比如这段序列是addgene一个plasmid的，表明是SA－2A序列
，也知道［］中的是2A序列。但是前面的话具体那段是SA呢，如果我需要在SA和2A之间
插入连个碱基，应该在哪里插入呢？
gcaagcttctgacctcttctcttcctcccacagggcctcgagagatctggcagcg［
gagagggcagaggaagtcttctaac
atgcggtgacgtggaggagaatcccggccct ］
或者各位大侠有没有常用的SA序列呢？非常感谢帮助指导。 |
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n*********p
发帖数: 151 | 42 哦。你说的是GFP带promotor 而不是GFP融合靶蛋白，如果只是GFP本身那当然有问题。 |
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c********b
发帖数: 363 | 43 我说的当然包括GFP融合蛋白。只要是35S driven的GFP融合蛋白的定位，除非之前已经
研究的非常清楚，不然大多数情况Plant Cell是不会放过的。
只有用native promoter driven的GFP融合蛋白能成功互补loss-of-function mutant的
情况下，plant cell才会认为OK。 |
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l***g
发帖数: 19 | 44 没用过这个载体的病毒质粒，不是很清楚。为啥目的基因和GFP之间要有IRES连着，GFP
不能和目的基因直接融合吗？一般IRES和筛选基因连着比较有用吧。如果你的GFP阳性
率偏低并且表达量不高的话，可以试着病毒感染后再挑选单克隆细胞，挑那种表达量高
的。 |
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b********e
发帖数: 50 | 45 这个估计楼上有几位根本就没看懂或根本没仔细看。常做动物实验的肯定就能明白区别
。说rosa-GFP-dta鼠，这个小鼠一出生全身是绿的。用Cre后去掉GFP, Dta表达，细胞
直接死掉。楼主这个小鼠是有Cre的细胞才表达GFP, 但细胞不会死。只有给DT这些细胞
才死。至于rosa启动子，LZ说了设计的时候是为了跟踪DTR阳性细胞。什么时间说rosa
能够survive了？我们实验室有很多cre鼠，我觉得这是非常有用的一个，至少在某些方
面比楼上提到的几个有优势。
B |
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q***7
发帖数: 144 | 46 看来你不但好多东西没有说，而且表达还真是有问题。你的中文真的很难理解，尤其是
上面的解释。还不如英文清楚，虽然英文也有很多错误。
你说RESULTING SEQUENCE包括。。。。（我们一般从测序引物的那边说起，你这却从离
引物最远的那边说起）说明序列都测过过那个LOXP区域了。但是你中文里又说P２之后
７０BP就停了。
你不是搞分子生物学出身的吧？用P２做引物测序后面都是DOWNSTREAM，应该说P２后７
０BP。这targeting vector也不是你构建的吧？知道为什么要扩那么长吗？你如果能回
答出这个问题 说明你还懂些分子生物学。
你这图比例严重失调，GFP６００BP左右，你EXON１５００BP左右，图中差别却是几倍
。还有，你P３应该在GFP后面离EXON１１００BP左右的地方，你却标到了GFP的中间。
好啦，现在回到你的问题。你不应该用P２来当测序引物，离你需要确定序列的地方太
近。
最早测序时，测序引物后面５０BP左右（甚至到１００BP以上）的序列是读不出来的。
所以那时的测序引物一般设计在需要确定序列的上游至少５０BP以上。大多数引物都
设计在要确定的序列上游１０... 阅读全帖 |
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s********x
发帖数: 472 | 47 split gfp 需要特别稳定的结合，因为GFP 成熟特别慢。
建议用split luciferous ，不需成熟，立刻有function。
但是背景比split gfp 高，不适合测定subcellular的location。 |
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s********x
发帖数: 472 | 48 split gfp 需要特别稳定的结合，因为GFP 成熟特别慢。
建议用split luciferous ，不需成熟，立刻有function。
但是背景比split gfp 高，不适合测定subcellular的location。 |
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p******b
发帖数: 379 | 49 我个人的经验是， 不同的细胞表达GFP的快慢也不一样， 同样的病毒同时感染两种不
同的细胞， 有的细胞出GFP的时候快， 有的细胞慢， 比如MM231 GFP在感染十几个小
时之后就非常明显了， 然而有些细胞48小时才明显
同样的病毒用相同的滴度感染不同的细胞， 感染效率也不一样。
可能跟细胞的病毒受体多少有关， 病毒进入不同细胞的快慢和多少不一样
当然同样是lenti， 不同promoter， 感染的快慢和效率也不一样
感染的方法可能也有点影响， 江湖传说reverse infection（感染当天trypsin细胞，
同时把细胞，病毒和HB一起加到培养皿）比普通的先铺好细胞第二天感染效率高一点点
， |
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j******i
发帖数: 939 | 50 IRES确实会导致不平衡表达，以致后边的gfp表达强度弱，但是正常情况下，也应该是
90-100% transfection efficiency,只不过gfp看起来很暗。如果要建立高表达细胞系
的话，可以不要gfp, 最后检测proviral DNA或者mRNA.
其实，你这个情况完全可以不用慢病毒。用piggyBac转座子更方便。piggyBac可以插入
100kb的dna。 |
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