g*********e
发帖数: 150 | 1 Formaldehyde, glutaraldehyde, alcohol, etc. does not "quench" fluorescence.
Instead, it denatures the GFP such that it no longer functions and
fluoresces. Any remaining fluorescence is either non-specific (many proteins
auto-fluoresce after fixation) or it is a few GFP molecules that retain
their original conformation. If you fix the tissue, then as Ann Cantereau
states, you MUST use an anti-GFP antibody to detect the GFP. At that point,
you are "seeing" the GFP by whatever tag you have on the s... 阅读全帖 |
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D**s
发帖数: 6361 | 2 1、美国
虽然近年来美国陷入困难境地，两场昂贵的战争和复杂的新项目，以及削减军事预算导
致五角大楼遇到无数困难，但是即使在这种情况下，美军仍在GFP排行榜上高居首位，
评分0.2208。
美国总人口3亿1666万人，适宜服役的人力资源总数为1亿4220万人。必要时可以征召1.
2亿名17至45岁的人入伍。每年能补充的潜在新兵数量为420万人。目前美军现役人数
143万人，预备役85万人。
美国陆军各类各型技术装备数量最多，总共8325辆坦克、25782辆装甲输送车、步兵战
车，1934门自行火炮、1791门牵引火炮和1330门多管火箭炮。空军、海军和海军陆战队
飞行器总数为13683架，包括2271架歼击机、2601架攻击机、5222架军用运输飞机、
2745架教练机，以及 6012架多用途直升机和914架攻击直升机。海军和其他机构目前使
用470多艘军舰、潜艇、快艇和辅助船只，包括10艘航母、15艘护卫舰、62艘驱逐舰、
72艘潜艇、13艘岸防舰和13艘扫雷舰。
尽管出现了最新型武器装备，美军仍然需要石油和石油产品。美国石油工业目前日产原
油850万桶，每天消费1900万桶。美国石油... 阅读全帖 |
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s******a
发帖数: 134 | 3 Could anyone please help me with some conditional KO questions?
Our lab have flox-transcription factor X-flox mice. I am thinking of
crossing these mice with some kind of
cre mice for conditional knockout of X . My purpose is to study the down
stream target of X. Specifically, I plan
to culture the cells in vitro , induce deletion of gene A in vitro, and to
examine gene expression between WT
and X KO cells. My questions are :
1) I hear that the efficiency of inducing conditional KO in vitro... 阅读全帖 |
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S*****s
发帖数: 287 | 4 如果 GFP 和 质粒一起做 cotransfection 的话很可能会遇到这样的问题，在难转染的
细胞上差别更明显。如果你把 GFP 和你的要表达的基因克隆到同一个质粒上应该就不
会有这个问题。我用 BAC 可以连另一个单独表达 GFP 的质粒，如果你要表达的基因比
较小，可以考虑用 IRES GFP。我们隔壁实验室用 Clontech 的 pLVX-IRES-ZsGreen1
克隆基因然后转 Neuron，效果也很不错。荧光强度比较高，而且每一个带 GFP 的
neuron 都能有基因表达，在电生理上能看到区别。 |
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A*******e
发帖数: 284 | 5 多谢各位的指点。我这个protein是个TF，差不多是个全新的蛋白，所以没有specific
antibody. 我加GFP是因为我想看它的subcellular localization. 如我前面说的，我
的vector没有问题，因为free gfp很亮，无论是看荧光还是western。 我的融合蛋白是
我把我的protein放N段，中间一点link， 还有一段his， 然后就是GFP。 在荧光下我
能看得到特异定位于核的GFP信号，所以我觉得我的construct没有问题。 但是western
出来的带就是非常弱，尤其是我把free gfp vector放一边做control的时候。 我觉得
问题是蛋白表达量很低，我已经把上样量放到极限了。 上面各位给的很好的建议，我
想都试试看 |
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m***o
发帖数: 272 | 6 实验室用ｇｅｎｅ（Ａ）ｋｏ的老鼠，我现在想分离一些原代细胞和干细胞再打回到
nude mice里去。所以想用ＧＦＰ或者luciferase来标记这些细胞，但是分离的细胞如
果in vitro转染的话可能影响分化，所以想得到A-/- GFP mice.
but A-/- 不能生育，所以必须用Ａ hetero（－／＋)来交配GFP wt,这样可以得到GFP
A-/+. 然后用得到的GFP A-/+ 之间互相交配，可以得到GFP A-/-的老鼠吗？就是gene
A KO 但是同时是ＧＦＰ＋的老鼠？
因为没做过动物，所以不知方法可行吗？
谢谢回复！ |
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s******r
发帖数: 2876 | 7 in vitro转染你肯定影响分化？
等你的老鼠杂出来，搞不好一年都过去了。
为什么不先试病毒。
实验室用ｇｅｎｅ（Ａ）ｋｏ的老鼠，我现在想分离一些原代细胞和干细胞再打回到
nude mice里去。所以想用ＧＦＰ或者luciferase来标记这些细胞，但是分离的细胞如
果in vitro转染的话可能影响分化，所以想得到A-/- GFP mice.
but A-/- 不能生育，所以必须用Ａ hetero（－／＋)来交配GFP wt,这样可以得到GFP
A-/+. 然后用得到的GFP A-/+ 之间互相交配，可以得到GFP A-/-的老鼠吗？就是gene
A KO 但是同时是ＧＦＰ＋的老鼠？
因为没做过动物，所以不知方法可行吗？
谢谢回复！ |
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h********n
发帖数: 4079 | 8 1. A-/- 不能生育是啥意思? 公母都不行吗?
2. A+/- x GFP ---> A+/-;GFP (1/4) x A+/- --- A-/-;GFP (1/8), 这里GFP都是
heterozygous. 最然1/8的比例低了点, 你弄个20 breeding pair, genotyping的时候
辛苦一点, 应该问题不大.
GFP
gene |
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c********b
发帖数: 363 | 9 我觉得你还是好好先做好western或者GFP观察，然后在FISU，那个比你做western难多
了。出现表型不是什么好事，应该是你agroinfiltration失败了。你看看这篇文章关于
agroinfiltration （Studying NB-LRR Immune Receptor Localization by
Agroinfiltration Transient Expression），里面提到了关于植物需要的适宜条件。
首先植物需要种在23－25度，打完植物需要放在22度左右光照12小时以上，持续光照有
利于表达。另外，这么大的蛋白不加P19几乎肯定不会表达。但是加P19的比例需要摸索
。菌种也很重要。如果你用GV3101或者C58C1应该没有问题。如果你用的LBA4404,那就
一般表达效率要低（在烟草中）。最好的是GV2260,我刚发帖去求了，我的一个HA
fusion蛋白也是表达很低（绝对不是抗体问题，positive control每次都work）。
你先找个postitive control，随便弄个GUS或者GFP来fuse一个HA都可以。你必须要有
posi... 阅读全帖 |
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C***2
发帖数: 62 | 10 Hey, i have aseveral questions to ask for help.
I want to knockin CreERT2 to specific locus, southern blotting suggested
that the ES clones are targeted correctly. But i am not sure if the CreERT2
is functional or not, therefore, i want to detect the function in vitro ES
based assay. My designed experiments is:
1) Electro-transfection of loxp-CMV Driven GFP-loxp plasmid to ES, the
transfected ES cells are split to 2 dish, one dish is treated with 4-OH,
another dish is conrol.
2) Prepare lentivir... 阅读全帖 |
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j****1
发帖数: 81 | 11 I'm a second year Phd student and I'm doing my prelim now. I don't know if
it's okay to post my proposal abstracts online for people to comment on.
This is one of the proposals I have to write for my prelim. I hope people on
this board could give me some feedback, especially ones that have relevant
knowledge. Thanks very much.
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Cancer stem cells are considered to be the source of tumor recurrence.... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 12 用GFP UV-corissing immunoprecipitated mRNAs assay
pls refer,
>
GFP-Based Method for Detection of mRNA-Protein Interactions
HeLa cells expressing N- or C-terminally EGFP/YFP-tagged proteins (Table S7)
were induced with tetracycline, irradiated with UV light, and lysed. GFP-
binding protein (GBP; GFP agarose trap, Chromotek)-immunoprecipitated mRNAs
were detected using an oligo(dT)25 probe fused to TRed dye (Sigma).
RNAs coimmunoprecipitated with GFP/YFP-tagged proteins were identified by
RNASeq. D... 阅读全帖 |
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l******3
发帖数: 25 | 13 50%是目测的GFP，会不会像上面说的，6k的基因在上游，GFP在下游，中间IRES连接，
所以导致GFP的表达受影响。我是想去sorting GFP阳性的细胞建这个基因高表达的细胞
系。
gfp |
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f*****f
发帖数: 195 | 14 谢谢。假如我希望表达fusion protein，不是用2A-GFP或ires，比如如上所面帖子，
ATG-GFP-exon1-...即把gfp插入到第一个exon之前可行么？另外，可以把GFP序列插入
到最后一个exon之后。在体外瞬时转染，gfp放在N或C端有时会影响蛋白自身，一般做
knockin的话，该如何选择？为规避这种，还是knockin一般用小tag的多？比如flag，
v5等等。 |
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s********3
发帖数: 231 | 15 《科学》对STAP手稿的专家评审意见曝光
《科学》对传说中的STAP细胞论文的三名评审专家意见，过去一直被雪藏，今天终于
被曝光。专家对这一研究的评价不高，认为非常全面的描述性研究，如果结果确定，可
能导致发育生物学大厦的颠覆，其实是不相信这种研究结论。因为没有当时的投稿件，
所以没有办法对这些评价进行更深入分析。不过这些资料显然都在某个地方，只是拥有
的人不愿意拿出来。
Retraction Watch readers are of course familiarwith the STAP stem cell saga,
which was punctuated by tragedy last month whenone of the authors of the
two now-retracted papers in Nature committed suicide.
In June, Science‘s news section reported:
Sources in the scientific community confirm that early version... 阅读全帖 |
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W*****n
发帖数: 21 | 16 试着整理了一下.
刚开始有人在Google论坛上说阿狗切不了内源DNA,也切不了转入DNA,自己太衰了,请高
手指点一下.结果有一群人都说阿狗切不动.
突然有个印度小哥debo说阿狗神勇,一试就灵. 与阿狗共转染的GFP质粒表达GFP蛋白明
显下降, 暗示GFP质粒DNA被阿狗切段, Fig 3C 被重复. 众人一追问,debo小哥说没做
DNA实验.看似印度小哥对T7E1实验不太熟. 众人讨论GFP蛋白表达下降也许是由于其他
因素,诸如导向DNA影响转译, 或是GFP质粒DNA转染效率本身在试验组和对照组中就有差
异.也就说对照不严格, 是个假对照. 过了几天, 印度小哥debo悄悄发贴说DNA实验结果
为阴性. 阿狗没有切DNA.
与此同时,更多的人表示Fig4 无法重复. 有人说实验是在293细胞中做的, 也许在HeLa
细胞中会有不同结果. 也有人明确说在HeLa中也不行. 无任何DNA被切证据.
突然又有个澳洲老哥Gaetan Burgio发推特说阿狗神勇,在受精卵中大切内源DNA, 效率
惊人, 而且这次是DNA证据. 有图有真相. 不过老哥好象挺粗心, 图也标错了,引起... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 17 RIP.
钱先生这一走，我最担心的是那个Prasher的饭碗了：
（Zt from WiKi）
Career[edit]
Prasher received his Ph.D. in Biochemistry from the Ohio State University in
1979. From 1979 to 1983, he worked in genetics and biochemistry research at
the University of Georgia, where he identified the gene sequence for
aequorin [1] .[4] He then joined the Biology Department of the Woods Hole
Oceanographic Institution, Woods Hole, Massachusetts where he studied
bioluminescence. In 1988, he received a two-year, $200,000 grant from the... 阅读全帖 |
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r****o
发帖数: 105 | 18 BDscience有专门表达GFP fusion蛋白的质粒卖。比如pEGFP系列。
我用过pEGFP-N1,感觉不错。你不妨试一试。
另外，GFP其实是个结构蛮紧凑的蛋白，即使没有很长的linker，
也应该不会干扰你要表达蛋白的折叠。比如我用的pEGFP-N1的多克隆位点
实际上与GFP就没有专门的linker sequence.但是表达出来的fusion protein
活性很好，而GFP折叠也没有出问题，免疫荧光实验看得很清楚。
如果你实在想加一个linker sequence,可以参考一下pEGFP-N1 多克隆位点
序列。
另外刚才查了一下文献，感觉linker design还是很有讲究的，对于较短的
linker,原则是要用flexible 和hydrophilic氨基酸。Flexible 的氨基酸，比如
Gly和Ala; hydrophilic的氨基酸比如ser。
有些情况比较复杂，较短的linker不行。比如有报道表达一个protein G
和luciferase的fusion protein，中间的linker是GGGGS。发现虽然luci |
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d*****r
发帖数: 2583 | 19 ☆─────────────────────────────────────☆
kaye (@_@~埋底海豚~愿做一颗秤砣心) 于 (Thu Feb 12 11:43:02 2009) 提到:
请牛牛们回答一下疑问。
我以前都是在活细胞里直接看GFP蛋白表达，现下想把细胞固定了还想再看另外一个内
源性的蛋白。请问固定后，GFP还能直接看吗，会不会失活就失去了发光性能了？另外
如果固定的话，能不能在4C或者-20C放一两天两三天的样子再做一抗和二抗（针对那个
内源性蛋白的），然后镜下观察GFP和内源性蛋白的表达？谢谢!
☆─────────────────────────────────────☆
iNGOR (葛大爷| 少灌水，多学习) 于 (Thu Feb 12 11:45:53 2009) 提到:
why not just search it and try it.
tons of papers fix cell and read GFP.
☆─────────────────────────────────────☆
AuldLangSyne (Auld |
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p*****y
发帖数: 44 | 20 测试的时候用hela，60mmdish +200ulvirus,通过GFP判断infection效率相当高。
Check GFP in 2-3 days after infection. The GFP you observed might be GFP
debirs. |
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D*a
发帖数: 6830 | 21 有Rosa26，是一个大家都不知道有什么用的位点，所以往里面加东西，理论上对其他基
因没什么影响
但是GFP的efficiency要先保证，才能保证你的pattern是真正的pattern，这里面有多
少个gfp你才能肉眼可见的问题，有从genomic KO到gfp protein表达的问题，有这个细
胞愿意不愿意gfp在那里呆着的问题
我们用rosa26 LacZ的老鼠，做出来的cre表达time line比直接用pcr晚。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 22 会不会Cre从转录到翻译，再到重组lacZ Reporter需要时间。
有Rosa26，是一个大家都不知道有什么用的位点，所以往里面加东西，理论上对其他基
因没什么影响
但是GFP的efficiency要先保证，才能保证你的pattern是真正的pattern，这里面有多
少个gfp你才能肉眼可见的问题，有从genomic KO到gfp protein表达的问题，有这个细
胞愿意不愿意gfp在那里呆着的问题
我们用rosa26 LacZ的老鼠，做出来的cre表达time line比直接用pcr晚。 |
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l*****m
发帖数: 122 | 23 谢谢你的建议:)
具体说说我的virus载体和transduction的过程吧~
1> retrovirus用的是MSCV based带有mir155 backbone的一个载体（某postdoc自己构
建的）有GFP marker。因为它只侵染dividing cell, 所以就在collect BM的当天做一
次spin infection （用fresh virus containing sup from transfected 293T cells)
，之后两天各做一次spin infection，然后让细胞在有GMCSF的medium里面继续分化到
day7 (中间换一次medium). 最后收细胞染色FACS. 现在结果就是no virus control分
化没什么问题，通常我得到90％ CD11c+细胞，其中MHCII+大概15％；问题是无论是
control virus (empty vector)还是有target shRNA的virus，细胞就不表达CD11c了 (
<10%），MHCII到没怎么变，还看过CD86之类的co-stimulatory molecul... 阅读全帖 |
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F******S
发帖数: 13 | 24 多谢楼上。我就是在普通荧光显微镜下看看， 因为我还有个C端NLS的GFP能很清楚的看
见GFP都在核里，现在换成NES却还是满细胞都是，和没加TAG的GFP一样，不知道是不是
需要用CONFOCAL才行。看了几篇文章都是从照片中就很清楚的看见GFP全都在胞浆里，
可是用他们的NES到我这里就没用了。
区别 |
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s******r
发帖数: 2876 | 25 对吧，GFP很容易被甲醇，乙醇破坏。
细胞表达GFP和shRNA，现在想用细胞免疫染色看靶蛋白水平是否下降了。
要用的二抗发光和GFP重叠。我怀疑这样行不通。
但老板告诉我，细胞固定透膜（用福尔马林和TRITON）过程中GFP被破坏了，不会影响
后面的immunumicroscropy 观察。
请问老板说的对吗？谢谢！ |
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l********t
发帖数: 2 | 26 pcdna3.1 v5-his和PCAGGS-GFP磷酸钙共转染原代神经细胞，然后染色GFP和V5tag，GFP
信号很强，但是V5信号非常弱，表达很低。但是HEK上共转染，GFP和V5都很强。是因为
PCDNA的promoter在神经细胞里不太好使吗？考虑要不要subclone到pcaggs载体里去。 |
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d**********2
发帖数: 103 | 27 小弟有点问题想向各位大牛请教：
小弟在用利用LENTIVIRUS在细胞里面过表达一个蛋白。
用得载体是LV-CMV-GFP, 包装载体是CMV-VSVG 和pHR`-CMV-R8.20-Vpr.
现在的问题在于，可以成功拿到表达GFP的病毒，但是拿不到能表达我的蛋白（GFP
fusion）的病毒（被感染的细胞没有GFP荧光信号）。
我在制造病毒的时候，我知道我的蛋白表达得很好（有特定得PATTERN， 荧光信号也很
强），所以应该是CONSTRUCT应该没有问题。问题可能在于我得蛋白会引起细胞凋亡而
影响病毒得产生和包装，但是我有相应的 non-toxic 的点突变，但是我也无法拿到表
达这个点突变基因的病毒。。。所以比较迷茫，想问问大牛们有啥好的解决方法。。。
。（基因不大，才700多BP。。。）
谢谢！！ |
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A*******e
发帖数: 284 | 28 请教，我用GFP融合一个转录因子表达，用western测表达量。现在发现表达量不高，
所以western结果不漂亮，free GFP的control倒是浓的一塌糊涂，请问有什么可以改进
的？
我用santa cruz的GFP-HRP抗体，现在看来似乎不好，出现了若干杂带，原本表达量就
不高，还搞些杂带就更麻烦了。 可有好的偶联HRP或AP的GFP抗体推荐， 多谢了 |
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z****u
发帖数: 1007 | 29 多谢楼上各位意见。 我可能会尝试COUP-TFII。因为samople是H2B-GFP表达老鼠，需要
GFP+arteriole marker. ephrinB2 staining如果过太复杂或者涉及antigen retrieval
,GFP可能会受影响。
另外我找到一个smoothelin 文献说特异表达在arteriole的SMC里，而不在venule的SMC
.
形态学上动脉和静脉还是很好区分的。但是我想最好还是用多个marker以及形态学一起
来验证我的GFP-expressing cell的位置。所以才在寻找这些marker |
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b**********8
发帖数: 349 | 30 最近开始自己包装慢病毒shRNA，用的是之前组里师姐的protocol，基本上是基于TRONO
LAB的protocol。之前师姐包装的病毒，效率很高，基本上能KD八成到九成。最近我自
己包装了两次，浓缩后根据之前师姐包装的病毒用量感染肝癌细胞，细胞生长速度明显
延缓，形态改变也跟之前的相似。但是做western却只能看到很marginal的蛋白水平降
低，在有的细胞株甚至完全看不到KD。我用GFP质粒转染HEK293FT，效率很高，24小时
至少看到90%的细胞有GFP表达，然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞，24小时候也
能看到至少80%的细胞表达GFP，说明包装过程中所用的包装质粒，试剂以及细胞应该没
有问题。我现在有两个疑问，请有经验的战友指点：
1）师姐留给我的protocol上，转染HEK293FT的方法如下，以10cmdish为例：
prepare the following transfection mix:
10.0 ug GFP(or other gene of interest)
10.5 ug pLP1
10.5 ug pL... 阅读全帖 |
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c********r
发帖数: 1125 | 31
我看了这篇原文了。。。没想到beutler也四处诋毁打压janeway得工作。。。。
提到得mezhetiev在seminar上得反击太太太犀利了。。。
唉唉。。。只能说beutler和hoffman都是“人精”，很会推销自己的工作得人。。。从
某种意义上也解释为什么炸药奖给了他们。
让我想起GFP那年的炸药奖。最先发现萤光发光，最先克隆gfp得都没有得奖，下村修得
奖算是评委会有眼光，但是doug prasher(克隆gfp得人）极其悲惨。。。最后没有工作。
marty chalfie在得奖2年前就在全世界开始宣传他得贡献，包括原始e-mail，稿件，
notebook扫描。。。他很有心机。
结果全世界都认为marty得贡献值得得诺贝尔奖，事实上他只是做出了第一个转基因gfp
线虫。。。而炸药奖一直标榜自己“重视原创idea，而不是应用。。。”
如果这也可以得奖的话，那么很多颁奖都应该重新改写：第一个做出transgenic mouse
得人没有得...第一个做出nuclear transfer得没有得。。。
包括很多物理奖得颁发，做出实验验证理论假设得都没有得，比如吴健雄。。。。 |
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g****9
发帖数: 163 | 32 最近做转染，想看看一段序列有没有promoter activity，用GFP跟另一个蛋白的fusion
做reporter。阳性的对照用的是CMV作为promoter，能看到GFP，但是效率非常。查了文
献，有的说CMV能在S2里表达（但量比较低） 有的说不能（那里说的是不能再KC细胞，
没有专门说S2）。所以想问下 有做过的 给个准确说法呢。 另外我要是就只想看看
有没有promoter activity的话，只用GFP作为reporter 而不是GFP跟其他蛋白的fusion
做reporter 是不是也可以的呢？ 新手呢，求狂拍 |
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i***0
发帖数: 160 | 33 GFP有自发荧光，如果做GFP的immunostain， 得避开其自发荧光的区域 （ex/em：485/
525）
另，你的negative control是什么？ 不表达GFP的细胞，还是表达GFP的细胞不加一抗
？ 如果第一次做，最好两个control都上一下， 这样便于trouble shooting。如果你
染的是组织切片，只加二抗的control会有荧光，尤其血管区，因为有IgG。比较样本染
色，其有正信号，而control没有信号的区域显示有该蛋白的表达
如果你染的是细胞，只加二抗看到的均匀的荧光背景，则如2楼所言；如果看到点状荧
光，则多为二抗没有洗干净。 |
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g***s
发帖数: 30 | 34 我在蛋白PA 的c-term接了个GFP， 得到PA-GFP， 转染果蝇细胞系Kc,用GFP作对照，可
以看到，control组形态正常，圆形。PA-GFP组细胞像长出了触角。PA可能是一个
transporter，没听说与细胞骨架有关系。各位认为一般什么样的基因可能会引起类似
的变化？ 或者，有没有可能是我的质粒质量不好，引起细胞的应激反应？？ |
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c********n
发帖数: 225 | 36 谈谈和蛋白打交道的日子 （三）
第三篇 选择的勇气 - Leaving Science？
看了Leon Avery的宣言“Leaving Science”，真为他感到轻松。虽然不同意他的做法
，但还是佩服他的勇气。如果对一件事情已经失去了兴趣，并总在自我怀疑而又觉得
forever trapped了的时候，再怎么做都会让自己很纠结而痛苦。对于自己和周围的人
都不是件好事，那还不如快刀斩乱麻的放下。感觉他不是“leaving science”, 而是
放弃一种他不喜欢的life style。祝福他吧。
勇气大多数时候，不在于冒多大的风险去做一件什么惊天动地的大事，而是长期的坚持
做一些小事，或是学会适时的放下。生物或者任何一个其他行当， 对勇气的需求在本
质上其实很相似的。我们做实验的时候，如果发现结果和自己的初始设想大相径庭，不
也是需要勇气去放弃自己最初的理论而总结出新的方向的吗？ 特别是如果这个理论是
出于自己的老板或者业界大师的时候。坚持或放弃，无论如何选择都需要勇气。
最近和实验室的科研人员打交道比较多，感受到了生物领域找工作人群在这一个时代浪
潮里的struggles。一个人... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 37 谈谈和蛋白打交道的日子 （三）
第三篇 选择的勇气 - Leaving Science？
看了Leon Avery的宣言“Leaving Science”，真为他感到轻松。虽然不同意他的做法
，但还是佩服他的勇气。如果对一件事情已经失去了兴趣，并总在自我怀疑而又觉得
forever trapped了的时候，再怎么做都会让自己很纠结而痛苦。对于自己和周围的人
都不是件好事，那还不如快刀斩乱麻的放下。感觉他不是“leaving science”, 而是
放弃一种他不喜欢的life style。祝福他吧。
勇气大多数时候，不在于冒多大的风险去做一件什么惊天动地的大事，而是长期的坚持
做一些小事，或是学会适时的放下。生物或者任何一个其他行当， 对勇气的需求在本
质上其实很相似的。我们做实验的时候，如果发现结果和自己的初始设想大相径庭，不
也是需要勇气去放弃自己最初的理论而总结出新的方向的吗？ 特别是如果这个理论是
出于自己的老板或者业界大师的时候。坚持或放弃，无论如何选择都需要勇气。
最近和实验室的科研人员打交道比较多，感受到了生物领域找工作人群在这一个时代浪
潮里的struggles。一个人... 阅读全帖 |
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T*****e
发帖数: 247 | 38 cycloheximide是inhibit denovo protein synthesis。
举个例子吧，比如你发现一个细胞事件很有趣、很重要。你想知道它是怎么被调控的。
那么有很多种可能，比如转录，转录后调控，翻译，翻译后调控。翻译后调控又分为很
多种，比如磷酸化修饰，translocation等等。那么怎么把目标范围缩小呢？早期的实
验方法，比如加转录抑制剂看看该细胞事件是否还发生，或者你说的这个加翻译抑制剂
，看看是否需要新的蛋白合成。比如学习记忆的机制里面，短期记忆有的需要蛋白合成
，你可以通过加蛋白合成抑制剂阻断动物的短期记忆来证明这点。而长期记忆还需要转
录的过程，那么你可以通过加转录抑制剂抑制长期记忆来证明。
研究一个protein的half life有啥意义？
我举第二个例子来说明这个。比如说现在很流行的用GFP这样的reporter来研究转录。
具体就是用一个增强子/启动子来驱动GFP表达。那比如说我有一个转录抑制子，我推测
它可以抑制上面提到的GFP的转录。那我把抑制子加到细胞里面去，等了24小时也没看
到什么变化，这能说明这个转录抑制子无效吗？未必。因为GFP的... 阅读全帖 |
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z*******9
发帖数: 112 | 39 谢谢各位的建议，
我首先监测了在293T trasfection时，蛋白的表达，IFA结果表明我目标蛋白表达良好
，基本是有GFP信号的细胞，目标蛋白都是表达的，
接着，我对我的细胞株用不同的抗体又从新做了IFA和WsternBlot，这次两次监测的结
果都是阳性，我都能监测到目标蛋白（这表明我上次IFA没有监测到我的蛋白很有可能
是抗体的原因）
不过，对细胞株的IFA又看到一个现象，我的目标蛋白并不与gfp信号完全重合，我可以
观察到有些细胞有很强的gfp信号但却没有我目标蛋白信号，或者反之，（重复一下，
我目标蛋白是和GFP fused with 2AA protease linker)?
请问各位，这是不是经常出现的现象？ |
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w*e
发帖数: 740 | 40 前阵子参加一个会议，有人podium 演讲提及到可以做non coding RNA 基因的GFP gene
targeting, 目的是用GFP 来看non coding RNA 基因的基因表达。我不解的是：既然
是non coding RNA, 这样做的话gfp会表达么？还是强制加上一个kozak序列让gfp开始
翻译？
谢谢 |
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r******k
发帖数: 446 | 41 我的shRNA的plasmid上带了一个GFP （IRES system） 然后我facs out GFP。 那么问
题来了， facs的时候有的细胞GFP亮 有的没那么亮。 是不是facs GFP最亮的那个群体
最好？这种群体的KD efficiency最高？ |
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d******t
发帖数: 27 | 42 韩自己回复搬运如下，他自己也承认图四有难度：槐北路 1
12楼今天 16:22
操作
我目前仍只有一个做实验的小团队，无法做好服务性工作，一天十几个个电话我都是重
复的以下内容：----所谓
高超的技巧，其实也很简单，细胞做好检测，不要有寄生菌污染，不要有支原体污染（
Ago系统对污染特别敏
感---特别是单转guide假阳性---我非常确定在没有污染的情况下，单转guid不会影响
GFP表达，假阴性也大多因为细胞污染，假阳性和假阴性我都遇到过，国内买的细胞我
就不吐槽了），转染用的质粒质量要好（可用30ngGFP转细胞，若是均一且效率高表明
质量好，强弱不均一则表明质量差，越不均一表明质量越差），guide磷酸化完全（没
有磷酸化不能load和切割---谢谢印证我的Fig2结果，至于怎么检测，自己跑个PAGE看
看---），特别的，对于Fig4，也是几乎惟一算是有难度的，就是控制转染时的细胞密
度和用血清控制细胞生长，时间稍长，毕竟NgAgo未经过系统的密码子优化---照着
online method上protocol for genome editing and T7E1做（小经验... 阅读全帖 |
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d******t
发帖数: 27 | 43 http://www.zhihu.com/question/46 ... mp;isappinstalled=0
韩自己回复搬运如下，他自己也承认图四有难度：槐北路 1
12楼今天 16:22
操作
我目前仍只有一个做实验的小团队，无法做好服务性工作，一天十几个个电话我都是重
复的以下内容：----所谓
高超的技巧，其实也很简单，细胞做好检测，不要有寄生菌污染，不要有支原体污染（
Ago系统对污染特别敏
感---特别是单转guide假阳性---我非常确定在没有污染的情况下，单转guid不会影响
GFP表达，假阴性也大多因为细胞污染，假阳性和假阴性我都遇到过，国内买的细胞我
就不吐槽了），转染用的质粒质量要好（可用30ngGFP转细胞，若是均一且效率高表明
质量好，强弱不均一则表明质量差，越不均一表明质量越差），guide磷酸化完全（没
有磷酸化不能load和切割---谢谢印证我的Fig2结果，至于怎么检测，自己跑个PAGE看
看---），特别的，对于Fig4，也是几乎惟一算是有难度的，就是控制转染时的细胞密
度和用血清控制细胞生长，时间稍长，毕竟NgAgo未经过系统的密码子优化---照... 阅读全帖 |
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m****a
发帖数: 270 | 44 是谁吃完饭没事干去跟方舟子告状？？
http://fangzhouzi.baijia.baidu.com/article/523403
不久前河北科技大学韩春雨在《自然·生物技术》发表论文报告了一种基因编辑新方法
NgAgo，在国内轰动一时。被《知识分子》作为末流学校土博士也能做世界一流科研的
典型，国内其他媒体随后跟进宣传，甚至称之为“诺贝尔奖级”的研究成果。
这几天我陆续收到几家实验室的研究人员的来信，反映重复不出韩春雨论文中最关键的
图4结果（切割基因组，T7E1和测序），呼吁我关注一下这事。
有些人已在网上生物专业论坛公开讨论此事，报告他们没法重复该实验，询问有谁重复
出来了。目前还未见有人反映重复出了图4结果。有的能够重复论文中的图3结果（FACS
和Western Blot），但那有可能是假阳性。
据听报告的人说，韩春雨在北大和遗传所的报告上都强调，他目前的NgAgo是初级版、
需要高超的实验技巧、等他推出2.0版和Smart版。这些说法跟他在论文里的描述是矛盾
的。因为他描述的只是个并不复杂的转染实验，T7E1和测序也都是现成的技术，并不需
要高超的实验技巧，按照其提供的... 阅读全帖 |
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g*****n
发帖数: 250 | 45 接着看Figure 5. 虽说准确地切掉stop犹如登天，作者还是要撞撞运气，跳过中间步骤
，直接测荧光。如果测到绿荧光，就表示eGFP in frame, 并表达。作者用flow
cytometry测量有绿荧光的细胞。具体怎么做的，不得而知，因为作者没有描述。从结
果上看，应该是，分别用RFP和GFP的激发波长来激发红（纵坐标）和绿（横坐标）荧光
。到这儿，问题出来了。RFP和GFP融合成一体后，两个蛋白会互相传递能量，即FRET效
应。这时，融合蛋白的最佳激发波长既不是RFP的，也不是GFP的波长。用GFP的波长来
测，显然脱靶了。 |
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发帖数: 1 | 46 GFP/RFP在两个同源臂的中间，自带promoter，不需要在exon上，为了移除荧光标签，
标签的两边连LOXP或者PiggyBac的TTAA-ITR。
左同源臂-ttaa-ITR-promoter-GFP-polyA-ITR-ttaa-右同源臂-promoter-BFP-polyA-
donor backbone
通过同源重组之后，左同源臂-ttaa-ITR-promoter-GFP-polyA-ITR-ttaa-右同源臂 会
进入基因组，如果donor存在randon integration，那么BFP也会表达，筛选BFP
negative/GFP positive/RFP positive的细胞即可。
然后过表达piggyBac transposase之后，筛选标签移除，变成左同源臂-ttaa-右同
源臂，
突变成功。
在设计左同源臂和右同源臂的时候，选择带有ttaa的位点分界，ttaa不要包括在同源臂
内。
说到这里，你是不是应该去补习一下基础理论知识。 |
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发帖数: 1 | 47 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: nohup (nohup), 信区: Biology
标 题: 钱永健去世
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Aug 31 15:40:09 2016, 美东)
http://www.sandiegouniontribune.com/news/2016/aug/31/roger-tsien-dies/
UC San Diego researcher Roger Tsien, who shared the 2008 Nobel Prize in
chemistry for helping find a more effective way to see potentially deadly
cells, died on Aug. 24th. He was 64.
Tsien died in Eugene, Oregon, according to UC San Diego Chancellor Pradeep
Khosla, who broke the news to the campus community on Wed... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 49 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: love2000 (爱情), 信区: Biology
标 题: 长江学者论文被举报 武大:不存在学术造假行为
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jan 29 09:25:32 2018, 美东)
关于李红良团队被举报学术不端的调查意见
武汉大学学术委员会于2017年4月收到关于李红良团队在相关论文中存在学术不端
行为的匿名举报，依据《武汉大学学术不端行为查处细则》，核实了举报线索，启动了
学术调查。在此基础上，学校学术委员会责成武汉大学人民医院组织校内外专家进行调
查。
2017年12月18日，武汉大学人民医院组织包括3名校外院士组成的5人专家组对李
红良团队发表在《自然·医学》（Nature Medicine）的CFLAR和TIMBIM1两篇论文进行
了学术调查，专家组一致认为“不存在伪造科研数据的行为”。
针对2018年1月出现的新质疑，武汉大学学术委员会2018年1月26日召开主任委员
扩大会议，学术委员会主任（院士）、3名在校副主任（含1名同行院士）、1名校学术
委员会同行院士委员参加会议，另行邀请了校外7名同行... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 50 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: love2000 (爱情), 信区: Biology
标 题: 长江学者论文被举报 武大:不存在学术造假行为
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jan 29 09:25:32 2018, 美东)
关于李红良团队被举报学术不端的调查意见
武汉大学学术委员会于2017年4月收到关于李红良团队在相关论文中存在学术不端
行为的匿名举报，依据《武汉大学学术不端行为查处细则》，核实了举报线索，启动了
学术调查。在此基础上，学校学术委员会责成武汉大学人民医院组织校内外专家进行调
查。
2017年12月18日，武汉大学人民医院组织包括3名校外院士组成的5人专家组对李
红良团队发表在《自然·医学》（Nature Medicine）的CFLAR和TIMBIM1两篇论文进行
了学术调查，专家组一致认为“不存在伪造科研数据的行为”。
针对2018年1月出现的新质疑，武汉大学学术委员会2018年1月26日召开主任委员
扩大会议，学术委员会主任（院士）、3名在校副主任（含1名同行院士）、1名校学术
委员会同行院士委员参加会议，另行邀请了校外7名同行... 阅读全帖 |
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