d**l
发帖数: 1546 | 1 depends on the type of GFP |
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z*******6
发帖数: 679 | 3 What kind of GFP you used?
The one we use is neutrophils from LysMGFP+/- mice... |
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q****m
发帖数: 116 | 4 现在想设计一个实验，用流式细胞仪分离GFP的单个细胞，然后测得细胞的代谢物水平
，但是不知道流式细胞仪的测得过程是否对细胞代谢或者测得结果有影响，请问各位大
侠，有没有这方面的经验，是否这样做过？给点意见，谢谢大家 |
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b*********8
发帖数: 44 | 5 请大家推荐一下那个公司的GFP抗体做Co-IP效果较好？ 我主要想在烟草里做。谢谢了！ |
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r***e
发帖数: 2539 | 6 GFP antibody IP好像都不好，
clontech的多抗可以试试，
santa cruz的B2单抗IP效率很低。
了！ |
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s********x
发帖数: 472 | 7 use GFP nanobody, they are much better. |
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l***g
发帖数: 19 | 8 日本MBL的兔多抗GFP抗体做IP，western，免疫染色都是极好的，强烈推荐 |
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n****k
发帖数: 516 | 9 GFP trap不错，好用，简单，可以request几个试用装，价格很便宜，用完了你实验也
做出来了。:) |
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e***o
发帖数: 344 | 10 想在一个细胞里同时表达GFP, RFP，BFP，不知道用什么办法能让这几个蛋白成像时各
自分得比较开，没有overlapping，（就像做DNA FISH那样），
不用很大的放大倍数就可以把几个蛋白分开.
不知道用弱启动子，或是加特殊的信号肽，比如锚定到细胞膜上或囊泡上什么的。
谢谢各位！ |
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e***o
发帖数: 344 | 11 有个问题，若弱动子的话，gfp可能也看不清楚，background 太高。好像不好弄啊。 |
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m*******u
发帖数: 173 | 12 前段时间有人推荐GFP trap, 请问用myc antibody pull down是不是特异性更高一些。
请问大家有什么推荐的？多谢了 |
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l**********k
发帖数: 189 | 13 我们卖之前先从GE公司sublicense了这个GFP专利。这些都是最基本的考虑。 |
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b*****n
发帖数: 1841 | 14 为什么先包埋再fix，GFP的信号会smear呢？如果包埋后再延长fix的时间，有没有可能
不smear？ |
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s********x
发帖数: 472 | 15 想找一对不影响细胞自然功能的人造蛋白-蛋白binding partner。
现在只知道有nanobody和GFP可以用。不知道还有没有类似的好用的蛋白对？是否有什
么好的reference可以参考？
万分感谢大牛赐教。 |
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b**********s
发帖数: 435 | 16 含有GFP，mCherry，Tomato的转基因老鼠
在什么波长的光源下，或者能不能看到发光？
虽然不一定能表达，只是想在做genotyping之前，想有个概念。 |
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w*e
发帖数: 740 | 17 如果A的抗体和GFP抗体一样好的话，应该没大的差别 |
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j*****n
发帖数: 135 | 18 换venus，比GFP成熟快，荧光强。split luciferase主要是有一步酶反应所以read-out
高。 |
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V******t
发帖数: 444 | 20 找了一下午，也没找到。
希望是GFP／YFP等任何荧光蛋白，前面有minimal promoter 或者TATA box之类的，可
以再前边接自己想要的序列；后面有PGK之类的promoter驱动的neo／hygro／puro等任
何筛选标记。
求推荐，在线等，谢谢！！ |
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l****y
发帖数: 398 | 21 我们做了一批anti-GFP和anti-mCherry的nanobody(15 KDa, single-domain antibody)
, 有两个用来做affinity purification/immunocapture很好用。
有需要的同学请通过站内信提供一个US non-profit research institute 的地址.
vector用e.coli 表达，periplasm加Ni-NTA纯化，一般可以拿到2mg/liter culture.
质量比多抗稳定，成本也低。适合需要做很多affinity purification的情况。 |
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m********2
发帖数: 317 | 22 是我的promoter比较弱，换个强的promoter可以提高GFP表达量，使细胞看起来好看，
但是有些toxic。
所以尽量用个本身就比较亮的蛋白。
顺便问问，还有其他颜色的比较亮的蛋白吗?
thank you |
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m********2
发帖数: 317 | 23 thanks, I ordered clover just now, whose brightness is 2.5 times than
GFP |
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B*****e
发帖数: 1005 | 24 大牛、小牛们，尽管目前生物学不景气，但我等小民还是要过日子，手头的事还是要顺
着做下去，讨口饭吃。
求各位求推荐一下ChIP中好用的GFP, Myc和HA的抗体， 多谢！ |
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d*****i
发帖数: 44 | 25 Abcam, ChIP grade GFP（#290）和Myc（#9123）抗体，HA不知道。 |
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r******k
发帖数: 446 | 27 GFP:Abcam
Myc HA我也用的abcam 或者santa 没啥问题 |
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w*********1
发帖数: 27 | 28 最近从别的实验室要了一个pEGFP-Tubulin质粒，转染HeLa细胞后本想拍活细胞里的微
观的，但是发现GFP信号无论在间期还是有丝分裂期看上去都是cytosolic without a
sniff of a tubule。起初怀疑是人家给我的质粒有问题，就自己找模板构建载体了，
自己构建了两个载体，一个是Tubulin-EYFP, 另一个是EYFP-Tubulin, 就是一个EYFP在
Tubulin C 端，一个在N端， 测序看读码框啥的都没问题。 但问题也来了，EYFP在
Tubulin C端的（Tubulin-EYFP）质粒表达效率特别低，虽然转染效率还可以，就是
EYFP的信号特别特别弱。 换成EYFP在Tubulin N端的（EYFP-Tubulin）质粒转染Hela之
后，效率倒是相当之后，荧光强度也超赞，但是和人家给我的质粒问题一样，都是
cytosolic without a sniff of a tubule。 请问各位老师有没有遇到相同的问题以前
？谢谢啦。 |
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C*******4
发帖数: 400 | 29 第二个methionine 可能会让转录起始从那里开始而不能产生长系列的融合基因，所以
你表达的只有EGFP或者TUBULIN。如果只有GFP那肯定是核和质里都表达。
link可以用GSL linker，Google一下就能找到。。
[在 winston0771 (kuba) 的大作中提到：]
：学习了，还真没考虑过这个linker和MET。您可以具体介绍下么？linker序列有特别要
：求么？Met指C端最后的那个氨基酸么？
：........... |
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m***y
发帖数: 627 | 30 这两天我刚刚构建好GFP-tubulin质粒并做了转染，效果还不错，Linker5个氨基酸，
Tubulin的第一个M去掉了 |
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s*****j
发帖数: 6435 | 31 听来的.
当年 GFP 的结构没解出来的时候. 几个组都在使劲干. Rice 里面的 George
Philips 组, 算是个牛组了. 一个中国哥么, 弄出来了晶体. 但是没法搞重金属测相
位. 一加晶体就塌了.
老中叫 Philips 出钱去欧洲的同步辐射中心去做, 不用加重金属. Philips 嫌太花
钱, 不干. 叫老中接着试重金属, 搞了两年, 就是不行. 最后终于同意去同步辐射中心
, 一下就做出来了, 但比另外一个组晚了几个月.
两年呀, 该算多少钱? |
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n********g
发帖数: 6504 | 35 人际关系、基金和命运对学者的无情嘲弄
From: Bhattacharjee 科研圈 2017-11-07
图片来源：Bryan Bacon/The Huntsville Times
撰文 Yudhijit Bhattacharjee
翻译 李杨
审校 张梦茜
编辑 魏潇
得知他曾经的同事赢得了科学界最伟大的荣誉时，这位荧光蛋白基因的发现者正驾驶着
一辆小客车。他在阿拉巴马州亨茨维尔市的一家本田汽车销售店铺做客户的免费接送服
务，以此为生。
诺贝尔颁奖典礼上的旁观者
2008 年 12 月，道格拉斯·普拉舍（Douglas Prasher）跟汽车店请了一周的假，去参
加在斯德哥尔摩举办的诺贝尔颁奖典礼。这是他和妻子吉娜多年来第一次度假。颁奖礼
当天，他穿上了一套租来的、所有男性参会者都要穿的燕尾服，还有一双从亨茨维尔商
店借的皮鞋。
在诺贝尔晚宴上，普拉舍坐在悬挂于七层楼高的天花板上那闪闪发光的枝形吊灯下，尝
到了第一口他 30 年来梦寐以求的餐后甜酒。当服务员把酒倒进杯子里时，他问是否可
以把瓶子放在桌上，却被服务员拒绝了。她告诉他这剩下的酒是工作人员打算晚点偷偷
喝掉的... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 36 你A+/- x A+/-只有四分之一几率得到A-/-, 如果再加上GFP +/0; A+/-之间互相交配，
更难了。而且交出来老鼠很乱，有的是GFP +/+有的是GFP +/0, 有的是GFP 0/0，你现
有的genotype protocol能区分开GFP +/+和 GFP +/0吗？
而且GFP一个copy和2个copy，有可能后期细胞里面GFP的颜色深浅都不一样。很有可能
影响你的判断。如果你只用单copy GFP，那么得到的老鼠又少了。
为了提高效率，你可以把GFP交到纯合GFP +/+; A+/-，然后用它们之间互相交配。但是
要注意一个问题，一定要确定GFP +/+老鼠要没有表型才行。 |
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j****1
发帖数: 81 | 37 Thank you very much for the comments. I revised abstract. It's attached
below.
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Colon cancer is the second highest cause of cancer deaths in the United
States (Markowitz & Bertagnolli, 2009). It is well known that APC (
adenomatous polyposis coli) loss predisposes patients to colon cancer, which
has been primarily attributed to the over activation of Wnt signaling.
Although controversial, can... 阅读全帖 |
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p*********3
发帖数: 8525 | 38 钱老轮回来讲讲，谁对谁错
方舟子老师：您好。
针对您昨天的文章，韩春雨回应了一些所谓的实验细节，见
http://tieba.baidu.com/p/4645810480?pid=93027569268&cid=0&from=prin#93
027569268，想必您也看到了。
他公布的所谓“高超的实验技巧”，包含三点：一是质疑者的细胞都污染了；
二是要做银染；三是要做GFP敲入（knock－in，KI）实验证明NgAgo可以work。
回应如下：
一，保证实验室的细胞没有支原体污染，不是什么高超的实验技巧，而是一
个正常实验室最基本的操作规范，比如每三个月定期检测支原体污染。
二，银染并不是什么高深的实验，而是使用了几十年的常规技术，按照
protocol配好buffer，把胶扔进去染色，没有人不会做。银染非常灵敏，反应速
度很快，容易出现信号饱和，不适合定量，容易产生假阳性条带。韩春雨的
Nature Biotechnology文章里面测试了50个位点切割基因组，每个都work，无一
例外，效率最低的也有15%（补充数据图5），高的有30%（图4）。这样的效率要
银染才能看到？普通... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 39 如果你要认真做的话，应该这么做：
用anti-GFP 来pulldown GFP-actin, 或者直接在细菌里表达GFP (or GFP-actin, 没有
活性没关系，反正是用来western), 或者直接到公司买点GFP standard protein
sample.
然后先跑胶用蓝染或者银染，对照已知浓度的BSA 来测定浓度，然后用这个GFP (or
GFP-actin)来作为标准浓度来对比你的细胞里面的GFP-actin来估算浓度。 |
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发帖数: 1 | 40 1 北京大学生命科学学院魏文胜课题组
我们使用了文章中报道的高效ssDNA，同时自己设计了其他2条针对体内其他基因位点的
ssDNA，与NgAgo表达质粒共转HEK293T细胞与HeLa细胞，2天及5天后，用T7E1检测切割
效率，这三条针对2个不同基因的ssDNA，在HEK293T和HeLa两个细胞系中，无论转染一
次还是在8到12小时后再转染一次ssDNA，都没有检测到切割。
针对敲除后能使细胞有表型变化的某特定基因，我们设计了ssDNA，与NgAgo表达质粒共
转HeLa细胞5天后，发现细胞表现出了一定的对应表型，但是把这部分细胞收集起来提
取基因组，对靶位点测序，没有发现基因组序列的任何改变。
我们针对某特定基因设计了6种ssDNA，用特异的荧光报告系统检测是否有靶点DSB产生
，结果显示所有实验组均没有检测到对靶位点DNA序列的切割活性。
2 中科院动物研究所王皓毅课题组
我们在293T细胞中表达带有Flag标签的NgAgo ，在不同时间点检测NgAgo蛋白表达。发
现转染6小时后开始检测到目的蛋白，随着时间的延长蛋白量增加。在人类293T细胞系
中重复原文章中Figure ... 阅读全帖 |
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r**z
发帖数: 37 | 41 试着说一下，不一定对
+/GFP：野生型/GFP-KI（KO）
GFP/-：不规范，理论上是 GFP-KI（KO）/KO
GFP/RA 不明白RA 是什么？
转基因的ＧＦＰ应该标为Tg(GFP)或Ts(GFP) |
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c********n
发帖数: 225 | 42 谈谈和蛋白打交道的日子 （七）
引子
光是个奇妙的东西。关于它的来源，各种族的传说都有异曲同工之处 - 中国有盘古开
天辟地带来光明； 圣经创世纪里有很权威的 And God said, Let there be light:
and there was light. 希腊神话普罗米修斯盗火给人类黑暗中带来光明，而自己却被
锁在高加索山的悬崖绝壁上，无怨无悔，忍受着宙斯的惩罚。
这篇咱们来散漫地谈一下生命之光吧， 只是一些体会，不严谨处见谅。
第七篇 生命之光
1.GFP
从一个“天才”对他学生们的challenge开始吧。 - “Tell me， why is GFP so
important to Biology？”
“天才”是他PhD老板在别人面前对他的赞誉。他每天的工作时间在14-16个小时，勤奋
带来的是各种荣誉以及源源不断的基金，即使在grant最黑暗的年代里，他的lab人员也
可以随心所欲的尝试各种方法。他的代价是一个人曲高和寡的寂寞， 在他娴熟悠扬的
小提琴声里慢慢的扩散，扩散。
回到问答， 年代flash back to GFP刚刚投入应用的时候。大家七嘴八舌，它是绿... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 43 For those who can not access the link
I copied the content here:
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NgAgo
15 posts by 9 authors
Davide Seruggia
Jun 23
Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide
k*****[email protected]
Jun 24
Hi, Davide,
I tried th... 阅读全帖 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 44 这其实就是问题。我个人感觉他俩不太可能共享炸药奖，至少从目前的贡献来看。两个
人有一个就不错了，clone channlerhodopsin的哥们应该会有一个位置(John Spudich
，Peter Hegemann),证明channelrhodopsin是光激活的离子通道的哥们也一定会有个位
置（Ernst Bamberg, Georg Nagal,Peter Hegemann)。
然后剩下的最后一个slot才会是用ChR2激活neuron的人，就算这个KD和EB也只能算是三
个最早的组之一（另外两个组在in vivo做的，还是Peter Hegemann, Ernst Bamberg,
和Georg Nagel他们几个xd)。
所以你看KD和EB现在都在玩命的做别的东东，一个是不停的优化ChR2（KD）,一个是不
停的优化整个delivery system(EB),一个是尝试用来做human disease(KD）。如果ChR2
最终真的能用来回答非常重要的生物学问题，或者治疗重要的人类疾病，那KD and/or
EB就可能自己拿个炸药奖，因为这时候发奖的侧重点就可能不一样了。... 阅读全帖 |
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d***s
发帖数: 1062 | 45 小弟正用逆转录病毒在小鼠CD4 T细胞中过表达目的蛋白。病毒质粒是MCSV骨架，目的
基因和GFP之间有IRES连着。对照组CD4 T细胞GFP阳性率有70%。实验组CD4 T细胞GFP
阳性率只有40%，而且GFP的强度也比对照组要弱很多。看了几篇文章转的是同样的基因，
同样也是逆转录病毒但是不同质粒，他们的结果就非常好，实验组GFP的强度和对照组
的差不多。
抱歉描述的有点乱了。我的问题是有什么办法能增加我的实验组T细胞GFP的强度，也就
是增加目的蛋白的表达量吗？先谢谢大家了。 |
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发帖数: 1 | 46 确实并没有排除假阳性。他是用GFP的表达来显示表达GFP的那段基因组序列有没有被破
坏掉，那么就有两种可能性，第一是GFP的基因组片段被破坏，第二表达GFP的mRNA被破
坏，第三种是GFP基因组序列被修饰沉默（这个我在hiPS细胞上发现过，很多时候如果
GFP自带promoter的话，这个promoter有被随机沉默的可能性。另外即使是把GFPknock-
in到某个蛋白的内部，也是有可能被沉默掉，这个我听一个中科院的人讲过，机理不清
楚）。对于第二种可能性，因为他是用磷酸化酶处理oligo，很有可能这个处理不完全
，还含有大量未被磷酸化的oligo，他的对照应该是那种没有通过磷酸化的oligo，确保
不是因为RNA破坏了mRNA。还是等他们的基因组测序结果吧 |
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发帖数: 1 | 47 当初从别的实验室弄来一个带GFP的lentiviral vector.刚开始的时候还想着这个载体
不错，到时可以通过看GFP来估量感染效率。
结果今天把cDNA终于克完之后，突然意识到一个问题。载体里的GFP序列也会链接到我
的LncRNA的序列后面，等于最后出来的transcript是：
5'LncRNA---GFP 3'
考！！！！
所以想请问各位大侠，有没有表达LncRNA的经验。
我现在有个想法，就是：
1. 首先确认GFP前面有没有IRES
2. 如果有，我可否在我的LncRNA后面加一段polyA,所以最后的序列就是：
5' LncRNA---polyA----IRES----GFP 3'
可行否？ |
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t******k
发帖数: 599 | 48 我有一个line是cre-ert2 A／gfp reporter。现在需要cre－ert2 B／gfp reporter／
floxed gene。因为lab里已经没有gfp reporter老鼠，那我可以genotyping cre-ert2
A／gfp reporter，用cre-ert2 A negative／gfp reporter的老鼠去和cre－ert2 B／
floxed gene直接cross么？所有老鼠都是b6 background，那我还需要考虑cre-ert2 A
／gfp reporter会有background问题么？ |
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发帖数: 1 | 49 9月28日Joe Miano
Most of you have already moved on from this discussion but I wanted to chime
in one last time with our negative data in the mouse. Whether we used
original plasmid or a custom NgAgo that was codon-optimized for mouse with
untranslated sequences, a Kozak Methionine, and polyA tail the results were
uniformly negative. We used a 5' phosphorylated ssDNA (both IDT bought or
in vitro phosphorylated) along with the mRNA to codon-optimized NgAgo and an
HDR template we used successfully ... 阅读全帖 |
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H***3
发帖数: 61 | 50 研究对象是原核生物cyanobacteria，通过标记一个蛋白GFP，看细胞内定位改变。野生
型里，破碎细胞后15000g离心GFP蛋白在上清。突变一个基因后，GFP蛋白定位变了，可
是破碎细胞后即使300g离心，GFP蛋白也在pellet里。现在需要做SDS和native gel分析
GFP蛋白的表达量和大聚合体分子量。可是问题是，如果做total protein loading不离
心，完全跑不进去空。我怀疑，这个基因突变以后，细胞代谢紊乱，产生了很多不知道
什么东西（多糖？），导致GFP蛋白被包裹，一般的detergent，boiling都除不掉。不
知道大家有没有建议？怎么除多糖？或starch？如果跟cytoskeleton结合紧密，怎么除
比较好？多谢 |
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