c******r
发帖数: 3778 | 1 compensate应该有至少两套图吧？
一套是GFP的，四张图，只有FL1有positive staining
一套是RFP的，四张图，只有FL2有positive staining
你这两套图看着像GFP和negative control的，没有RFP的？ |
|
c******r
发帖数: 3778 | 2 嗯，这个确实更好。但是用GFP有个问题，GFP非常稳定，一般表达量会比较高，不知道
会不会false positive。
你这个idea是对的，不过找什么可能还需要考虑一下。 |
|
z********i
发帖数: 610 | 3 1.看到有帖子说细胞污染的事情，我也有遇到了很奇怪的事情。我的细胞养时间长了以
后，比如2-3周，形态会发生很大的变化。比如Hep3B会变成293T那样的形态，不知道是
不是因为细胞污染的缘故？
2.我手上有一个蛋白,当我用GFP-tag去看定位，发现呈现点状定位。如果用FLAG-tag则
是弥散的（没有内源的抗体）是不是因为GFP dimerization影响了它的定位呢，或者是
因为TAG太大的原因？
谢了 |
|
s******a
发帖数: 134 | 4 conditional KO 的efficiency 能用reporter (比如GFP）看到的，GFP一般加在哪里呢
？ |
|
m*********n
发帖数: 215 | 5 用病毒转染干细胞line,可以转好几个基因么？譬如说，先转一个GFp，把GFP＋的筛选
出来enrich了以后再转进去个别的基因，依次类推。 |
|
d*p
发帖数: 534 | 6 Do you have a empty vector as control? I don't like puromycin. All of my
shRNAs were cloned into plko.3G. GFP will tell you the infection rate. And
you may sort the GFP positive cells. |
|
H****s
发帖数: 301 | 7 I have tried DH5a/Top10/XL-1blue and it did not work neither.
I am very sure that there is no problem with my cut vector because I used it
to do library of huge size and never got any problem. I routinely use this
vector and same restriction sites for library cloning and never failed.
To make sure it is not cloning problem, I also did another control ligation.
Using the same materials, I ligated GFP fragment into the vector and got
tons of green colonies after induction. From the GFP control exp... 阅读全帖 |
|
D***y
发帖数: 693 | 8 最近开始用293Tproduce lentivirus，收集上清后过0.45um filter,然后Infect cells
。24小时后check GFP，只有很少的细胞gfp positive的，而且是一簇一簇的。看形态
像293T细胞，想问各位一下：0.45um filter 能把293T去掉吗？
多谢！ |
|
|
d**********2
发帖数: 103 | 9 小弟想向各位大虾问一下caspase 3/7 的问题：）
用得是promega 的 Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay kit
小弟想 用不同GFP融合蛋白转染293T 细胞然后用这个KIT监测Caspase-3/7 的活性 但
是结果很奇怪
用Staurosporine(10uM, 5H)诱导细胞凋亡所产生的信号比GFP空载转染的细胞的信号还
低。。。
所以想问问到底是什么问题。。。 |
|
j****g
发帖数: 406 | 10 因为进了genome的片断会丢失吧，我猜。一般来说不会只进去一个copy number,多的话
可以达到十几个，但是当然蛋白不一定会有十几倍了。
那个database是用GFP做reporter，直接看到的就是GFP signal越来越弱。我不知道是
不是有人用southern confirm copy number过。
但是只是听说过，不知道会发生的可能性有多大。 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 11 我说这个就是因为听人提起来好像有篇文章说是转gfp进去，然后发现细胞
对GFP无爱，加了很多methylation上去，直接抑制表达了 |
|
m****r
发帖数: 383 | 12 把Ad-Cre打到mammary gland of a Cre reporter mouse,理论上会诱导gfp的表达，只
是不知道从注射，到cre-mediated recombination发生，直至gfp蛋白表达，这个
过程需要多久？一周？ |
|
z*t
发帖数: 863 | 13 就是tet1啦，大家发现这个东西会给甲基胞嘧啶加一个羟基，非常可能是大家一直苦苦
寻找的去甲基化酶，而现在的paper都在 map in vivo 5hmc position，和Tet1到底起
什么作用，Hongjun这篇用了SssI甲基化tranfer plasimid的promoter，silence GFP
expression 并且 cotransfer Tet1 expression plasimd观察Tet1可能的去甲基化作用
，并观察了其他的factor的引入对GFP silencing的影响。其实是很聪明的，大家说他
取巧多是因为他并不是这个领域的，用这种比较tricky有点artifacial的system赚一篇
cell。但你如果看过最早的Tet1 paper会发现其实更好玩，这个酶是丝虫（导致昏睡病
那个）里面一个修饰甲基胞嘧啶的JBP1/2 blast出来，其实和可能的DNA 去甲基化很难
看出直接的关系。。。 |
|
g******1
发帖数: 244 | 14 FACS都是收集GFP-tagged cells,现在我手头的材料是GFp cell是对照，non-tagged
cell是
样品。我能不能把sort出来的non-tagged cell做实验？纯度能达到要求么？ |
|
V********n
发帖数: 305 | 15 你可以设定不同的sort参数，得到你需要的细胞，GFP+或者GFP- |
|
s******s
发帖数: 13035 | 16 一个我做gfp reporter的endogenous promotor太弱了，有什么办法
enhance一下吗？比如类似uas-gal4的系统加一层转录调控放大？
因为要看live cell, 所以不能用gfp-antibody |
|
i*********0
发帖数: 915 | 17 我用的是pcag-gfp-cre 作的transfection，然后sort out gfp positive cells 作培
养。 |
|
g*********d
发帖数: 233 | 18 《Cell》文献翻译:基因表达的小RNA调节因子
Cell 134, 899 – 902, September 19, 2008
Joel R. Neilson and Philip A. Sharp
今年Lasker基金会承认了Victor Ambros、Gary Ruvkun和David Baulcombe在推断
小RNA分子在真核基因表达的转录后调节中所进行的开创性工作。
分子生物学是一门年轻的学科，如同充满了未开发土地的新大陆。有关小RNA在基
因调节中的作用的重要发现是这门年轻学科中还有许多未开发的重要领域的一个例证。
9月26日，几位先驱（麻州大学医学院的Victor Ambros、麻州总医院和哈佛大学医学院
的Gary Ruvkun和剑桥大学的David Bulcombe有关小RNA的发现将被授予2008年Albert
Lasker基础医学研究奖。
历史上先驱者以及他们的发现的意义通常被忽略，只是在很多年之后才被承认。
Ambros和Ruvkun所发表的描述第一个微RNA及其标靶的优秀论文（发表在高深的Cell杂
志上）被忽略了近10年。与此同时，... 阅读全帖 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 19 不是imprinting, x-inactivation一类的？我就不知道了 |
|
|
|
m*********n
发帖数: 215 | 22 等一下。。。你这个homozygous和heterozygous的表达差别难道和copy number没关么
？两个copy和1个copy的区别？ |
|
F******S
发帖数: 13 | 23 想让带GFP标签的蛋白只在胞浆里表达，用了MAPKK的NES序列ALQKKLEELELDE加在C端，
不管是1xNES 还是2xNES 都不见效果，折腾了要2个月了，现在准备换个GFP的质粒把
NES放到N端试试，不过也不抱太大希望。请问版上牛人哪位有这方面经验的，给个好用
的NES序列试试。小弟在此叩谢了！ |
|
d****7
发帖数: 109 | 24 PFA肯定不会让GFP损失，但是GFP据说不喜欢甲醇 |
|
f**u
发帖数: 346 | 25 我以前差点被GFP误导过。
当时我转完以后显微镜底下一看，很开心，几乎每个细胞都是绿的，虽然大多比较弱。
结果偶然不小心转到RFP的channel去了，发现居然几乎每个细胞都是红的。
仔细对比了一下红的和绿的的pattern，居然是一样的，
所以我的结论是这些都是自发荧光，只有那几个特别绿的细胞才是转染成功的，
那些在红色channel里是看不到的。所以效率其实是很低的。
我到现在也不明白为什么会有自发荧光，没转染过的细胞是没有的，
也许是转染试剂造成的吧。
我不是说你的转染效率也有问题，我只是想把这个问题提出来，
在估计转染效率的时候对于GFP可能要小心。 |
|
s******r
发帖数: 2876 | 26 PCR的也不是院士吧，GFP都要开bus了。
屠呦呦？
个人推崇她的贡献，管什么水平高低。袁隆平没评上据说也是有人质疑他水平不高。
对了，那个发明PCR的家伙，水平也不高。克隆GFP的那个家伙，那就更没有水平可言了。 |
|
m******h
发帖数: 32 | 27 各位同仁，我最近在动物细胞中表达一个150的膜蛋白，当在C端加上一个GFP后定位和
功能都正常，然后根据实验需要（FRET），我在GFP之后又加上了一个RFP，中间以一个
50Aa的柔性linker连接。
结果我杯具了：
1，蛋白表达量急剧下降。
2，表达的蛋白都不是去外膜上了，而是trap在各种内膜上，或者说聚集在一起。
但是两个颜色的荧光还都能看见。
目前有点手足无措，不知从何开始改进，各位帮忙给支个招吧，拜谢了！ |
|
s******y
发帖数: 28562 | 28 我们有anti-GFP抗体，的确在预测的位置上。但是我们想用这个做某些其它事情，
所以必须用原来的抗体来检测。单用GFP 的话reviewer 不会放过我们的。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 29 我们有anti-GFP抗体，的确在预测的位置上。但是我们想用这个做某些其它事情，
所以必须用原来的抗体来检测。单用GFP 的话reviewer 不会放过我们的。 |
|
m******5
发帖数: 1383 | 30 我请教个欠揍的问题啊……就一个啊…… 楼主确定你的蛋白功能正常么？
另外，如果GFP挡了抗原决定簇，为什么换另一个抗体也不行？
另外，楼主的GFP光谱正常么？ |
|
n****0
发帖数: 696 | 31 我也觉得他说的方案是最佳的，但是我就想后面接个GFP，本来直接放vector里就行了
，按照他的方法我还得重新设计引物，把promoter和GFP fuse到一起，我觉得不该这么
麻烦吧，所以问问大家是怎么做的 |
|
k***g
发帖数: 4904 | 32 对哦。我以前用个cyanobacteria就是autofluorescent，多省事
gram+的是S.aureus。不过其实不一定要用这个。我正好问问别人。
改造表达gfp的菌一般能培养多少代gfp变很弱啊？我以前见过别人用好像几代就变弱了？ |
|
a****d
发帖数: 1919 | 33 不清楚具体质粒结构，不过如果只是过表达一个蛋白，没有另外fusion其他tag或者GFP
fragment的话，你这样操作就够了，不需要担心移码问题。如果你另外fusion GFP或
者其他tag，则需要考虑表达的cDNA和连接的tag in frame。 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 34 he/she can try stimulated-emission depletion (STED)
paper:
htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16896340
>We report attainment of subdiffraction resolution using stimulated emission depletion (STED) microscopy
with GFP-labeled samples. The approximately 70 nm lateral resolution attained in this study is
demonstrated by imaging GFP-labeled viruses and the endoplasmic reticulum (ER) of a mammalian cell
Brand:
Super-Resolution Microscope Leica TCS STED
htp://www.leica-microsystems.com/products/confoca... 阅读全帖 |
|
p******d
发帖数: 3737 | 35 不是GFP，是YFP的antibody，做IF。实验室里面有的都是主要做GFP的，试了一下，不
太好。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 36 ub-GFP 只能作为参考。因为Ubiquitin 和proteasome 其实不是严格
的紧密联系关系。
如果只是一个支持数据，那么ub-GFP 可以用，
如果是非常重要的结果，那么必须用其他方法来重复这个实验。 |
|
V***b
发帖数: 3419 | 37 嗯，是这样。ub-substrate在降解前还要de-ub，所以de-ub的效率也影响proteasome降
解该底物的速度，而且de-ub的酶还很多，针对每个底物还不一样。我想的是最简单的
方法用cell lysate，然后把ub-GFP丢进去，温育一段时间，然后看看底物省多少。如
果ub-GFP加速降解，我至少可以说UPS在这个细胞里活性增强了。不过感觉挺弱的。
我现在正在搞35S pulse-chase看global protein turn-over，但这个细胞的autophagy
和lysesome都变了，试验结果不容易阐述啊。。。就怕reviewer到最后猛踩我一脚，我
就无法翻身了。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 38 用来测proteaasome activity 的 ub-GFP必须是那种不能被cleave 的ub，
否则表达过程中就被抢先cleaved 了。
所以这个de-ub 不是一个问题。
成问题的主要原因是因为ubiquitinylated protein 也能成为lysosome,
autophagosome的底物，所以不是那么的特异。
如果这个问题对你们非常重要的话，我建议你用三种方法来重复：
1. uncleavable ub-GFP
2. P53 or H1f, by using cycloheximide or pulse trace
3. partially purified proteasome with artificial substrate
然后再加上一个加beta-lactone 的逆对照
autophagy |
|
m*****j
发帖数: 144 | 39 打算用2种不同荧光蛋白标记2种不同的细菌，然后看它们的互作关系。目前，有一种细
菌已经被GFP标记了（用GFP-vector转化到这种细菌里面），现在的问题是 是不是还得
用同样的方法制作第二个荧光标记菌？有没有其他比较简单快速的方法呢？而且买荧光
标记质粒好贵啊。 |
|
i*********0
发帖数: 915 | 40 用了cmv和cag promotor的载体,GFP empty vector 表达还可以,不过GFP-fusion gene
就不行了,挑单克隆以后看不到荧光信号了,做WB检测fusion protein量也很低.
有没有更强一点的promotor? |
|
p*l
发帖数: 1359 | 41 Try structured illumination microscope first (100 nm resolution). This kind
of microscope is not everywhere but you should be able to find it somewhere.
If structured illumination doesn't work, you need to use super resolution
methods. Very few places have them. You probably need to change your
labeling method depending on what method you want to use. GFP is not the best choice in super resolution. The only method that had been successful with regular GFP is STED. Other methods are PALM, STORM. |
|
c*t
发帖数: 1063 | 42 被问到一个问题，不知道怎么回答，特来版上求助。
Immunostaining showed two proteins co-localize in the membrane, question is
to confirm that the two proteins directly bind each other.
First, I was thinking about co-ip, but this method does not exclude the
possibility other proteins are also involved, so it's hard to tell direct
protein binding with co-ip.
Second method I was thinking about is yeast two-hybrid, which is just to
detect the interaction of two proteins. But drawback is false positive.
Third method is a comb... 阅读全帖 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 43 一般而言是可以的，除非非常不凑巧的是你的那个基因正好和整合后的GFP
位置在同一个染色体上。
GFP
gene |
|
s******y
发帖数: 28562 | 44 在他们的实验里，貌似并不关心是否GFP +/+和 GFP +/0 吧？只要随便弄出一个
有标记的就行了。 |
|
D*a
发帖数: 6830 | 45 总不能只打一只啊
反正我就是提供思路，楼主不关注就最好～
不过gfp+- 交配还是不如gfp++交配效率高。但是前期实验没有必要等两代就是了。 |
|
a*****x
发帖数: 901 | 46 更快的方法是用Talen或者ZFN knock-in GFP，我们做过不会影响ES分化的。还可以
knock-in在gene A的locus同是做knockout,这样连knockout老鼠都不用了。
GFP
gene |
|
h******t
发帖数: 56 | 47 我和你有一样的问题。也是用的pEN entry vector 然后做LR reaction 到目的lentivirus vector 里面。我的三个蛋白都有GFP，所以我能测到virus的表达。但是titer非常低，大概只有5%这个样子，而我的GFP control可以有40%。我的这个project暂时已经不做了，就是因为无法表达我的蛋白。现在看到你的帖子，觉得很有可能我们是同样的问题。可以考虑用一个不需要LR reaction的vector来试试 |
|
l****o
发帖数: 442 | 48 online搜索了一下，有人说必须要专用滤光片，有人说跟GFP一样直接用蓝光激发就能
看到比GFP弱一些的绿色荧光。
因为本人实验室经费有限，如果就普通倒置荧光显微镜下观察比较方便，不知道可不可
行，恳求做过的网友给予指导。
谢谢 |
|
b******s
发帖数: 1089 | 49 首先恭喜你取得了进展。
你们基因对应表型的工作如果很solid的话，应该可以考虑上plant cell。
因为这个蛋白是个未知功能蛋白，从保守domain和功能domain下手是比较传统的考虑。
但是现在看起来应该是很费时费力，并且很可能很难得到最终的确定结果。我觉得不如
跳过这一步，而直接从其他角度开研究这个蛋白的功能。
如你说的，这个是一个核蛋白（GFP有时候并不完全可靠，free GFP也能定位到核内）
，可以考虑转录因子或者参与Chromatin remodeling等。如果你想搞到这个蛋白的
interator，当然很好。但是会费时费力，尤其是植物里，很多实验很难做。我不建议
朝这个方向。而且很多时候这个很可能跟一堆蛋白有interaction，结果转了一圈又回
到原地。
你还不如做个这个gene的inducible表达系统去看microarray。尤其是当你们已经知道
这个基因的功能跟凋亡和胁迫有关，很可能可以找到一些下游的重要基因。如果运气好
，找到一些重要的下游基因，后面的工作就够你5-10年做的了。
关于杂志.CNS恐怕会有难度，但是plant cell应该很有机会。... 阅读全帖 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 50 Continue again:
YFP/GFP/Luciferase etc bioluminescence marker methods
for measurement of clearance rate constants within living cells
please refer
Science 2011 paper (YFP):
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21233346
and 2012 paper (GFP) :
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22499809
Ps:
Below both figures were from 2012 Science paper its Supplementary Materials document,
web link:
//www.sciencemag.org/content/early/2012/04/11/science.1221920/suppl/DC1
Good Luck for your CNS revised version submission. |
|
