L***s
发帖数: 133 | 1 Thanks. 用过两种方法做IHC。
1。 rabbit GFP一抗，goat-anti-rabbit－488 二抗
2。 rabbit GFP一抗，goat-anti-rabbit－Biotin二抗，ABC（vectors), TSA（PE ）
2 结果明显要好于1，信号放大效果很明显，但是阳性细胞数量还是有限
对于ＧＦＰ在固定中活性disappear，有办法避免或复原吗？ |
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L***s
发帖数: 133 | 2 Thanks
主要是想找个非rabbit的GFP抗体做double IHC，刚order了Abcam的chicken GFP
anti- |
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f***4
发帖数: 886 | 3 不好意思，顾着看八卦了。
现在我手头没有文献，明天我问问别人看看。但是我们的经验就是YFP强的多。
另外Abcam rabbit anti-GFP的抗体最好了。
Aves Labs Inc 的Chick GFP 也不错。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 4 also fusion-GFP sucks most of time...
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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c********u
发帖数: 250 | 5 Invitrogen Gateway C-terminal GFP destination vector pcDNA-DEST47 克隆的蛋白
为什么不亮呐？非得每次再用anti-GFP染一遍才有暴亮的荧光，为啥啊为啥，有没人碰
到过同样的问题？ |
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H******d
发帖数: 13 | 6 在野生型蛋白的C末端融合GFP后，转入到knockout株系，knockout的表型完全恢复，融
合后的mRNA是正确的，也能用 GFP 抗体检测到期望大小的融合蛋白。本来以为能过一
个快乐的新年了。可是在confocal下根本就看不到荧光，郁闷死了。在线等大哥哥大姐
姐帮帮俺，有哪些可能的原因造成这种现象呢? 谢谢啦！也祝你们新年吉祥如意！ |
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v*********d
发帖数: 382 | 7 Ectopic expression 经过几代后很容易就被silence掉了。
你的construct 如果是transient expression, 有没有GFP? 如果有
1，你现在的细胞株可以试一下染色，看看能不能检测到
2，从新做, 挑有GFP的单克隆， 再做个western 看看对不对 |
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H******d
发帖数: 13 | 8 谢谢您的指点。俺觉得很可能是融合后，我的蛋白功能没有受到影响，但融合导致GFP
本身出了问题，尤其是我这种直接在生理条件下测试。实在没有办法的用CONFOCAL观察
的话，俺得用GFP抗体来搞传统的生化定位了。
..
protein |
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t******y
发帖数: 716 | 9 GFP 蛋白的可视性依赖于蛋白的表达量。你这个情况明显是因为GFP的融合蛋白表达太
低，显微镜下看不到。估计你的目标蛋白在细胞里的浓度是受到其他蛋白严格控制，所
以融合蛋白的表达量也受到控制。如果用IP，或western估计还是可以看到。 |
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m*******u
发帖数: 173 | 10 LZ, Shake hands. Same problem in Arabi and tomato in my project. Our
collaborator met the same problem, because the fluorescence of GFP is weak.
He changed another type of GFP and with a translation enhancer in his
construct, then he got beautiful images. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 11 You Sure?
>也能用 GFP 抗体检测到期望大小的融合蛋白
回复]
发信人: LifeHouse (Victoria), 信区: Biology
标 题: Re: weird GFP fusion
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jan 25 21:54:09 2012, 美东)
in frame?
or after you cloned in, you generated a protease cleavage site or a stop
codon? i would
sequence it first, then BLAST the linker sequence to see what comes up.
codon? i would |
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l**********1
发帖数: 5204 | 12 De rien.
Plus another one paper:
htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22203841
>Grey scale images are generated, reproducing the fluo- rescence intensity
in different tissue components (Figure 1). The estimated resolution is 0.5
μm in lateral direction and 1- 2 μm in the axial direction
full text link:
htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3235701/pdf/DRP2012-810749.pdf
if LZ can not recognize 200 μm scale labeled GFP particle color signal just try at least 30 μm or more sensitive
likes above ... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 13 Oui
but
Selection of expression vector is also VIP.
to little or no expression based on EST, MPSS, or microarray data using
reporter (GFP)
cited
>
The aim of our study was to examine the in vivo expression of many
Arabidopsis genes of unknown function that show little or no expression
based on EST, MPSS, or microarray data using reporter (GFP) genes driven by
their native promoter and thus learn something about their potential
function. In this study, we selected 627 Arabidopsis genes with unkn... 阅读全帖 |
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b******s
发帖数: 1089 | 14 请问这个有很多证据吗？如果这样，那么GFP fuse的蛋白定位岂不是不够准确。很多是
蛋白降解后剩下的free GFP？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 这种情况其实不普遍。
另外，如果融合上的蛋白是被各种蛋白酶来降解的话，的确常常会留下一个孤零零的
GFP, 但是如果是被proteasome 降解的话一般会把GFP也同时降解了。 |
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i***l
发帖数: 1656 | 16 i have hands on experience on this, correct, fusion protein with gfp tag is
usually more stable that itself
of course you should confirm the stability when you do subcellular
localization
GFP fuse的蛋白定位 only when the fusion is stable, commensense ba |
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c********u
发帖数: 250 | 17 请问有人做过GFP in situ 吗，我知道听起来很怪异，可是我们的一个construct就是
只有GFP的mRNA，看不到蛋白。诚心请教，谢谢 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 18 RE LZ
here you go
Plasmid Information
Toolbox-No. 114
Functional Description Retroviral expression vector derives from pMIG;
the GFP of the original IRES-GFP casette is exchanged with the enhanced cyan
flourescent protein. . The vector allows cloning of genes of interest on
the N-terminus of IRES for co-expression with CFP in cells.
web link:
http://www.bioss.uni-freiburg.de/toolbox/products.php?PL-62
then pls send mail to German side for it:
link:
http://www.bioss.uni-freiburg.de/toolbox/... 阅读全帖 |
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b*****n
发帖数: 1841 | 19 组织中有RFP和GFP，如果要染色就只有选蓝光了，而蓝光很弱，另外如果要做co-
staining就没得选择了。
有没有办法把RFP和GFP的荧光彻底bleach掉，但是不影响后续的staining？
谁给个详尽的protocol，有包子。 |
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z****u
发帖数: 1007 | 21 O/N PFA 固定应该没事啊
我的protocol一般都是这样的。
你有没有做antigen retrival啊。 然后一起染GFP和别的Ab. GFP antibod很好的，很
特异。 |
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z****u
发帖数: 1007 | 22 不fix的话细胞膜会裂解，GFP就漏出了。以前我做胚胎sample的时候如果没在3小时以
内固定的话，GFP都会leak out. 看起来就是一片smear. |
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z****u
发帖数: 1007 | 23 leaky 是组织细胞腐败降解了。 跟冻融没关系。单次的组织冻融不影响，比如-20度保
存很久的老鼠解冻后再固定也没啥问题。 leaky一旦发生就没法解救了，sample只有
扔掉。所以我的sample都是杀死后立马扔PFA. 一般来说GFP或者TdTomato 都不会被PFA
灭掉。 实在灭掉了那就上Ab . 很多公司都有很好的GFP antibody.很特异，很强。
组织一旦固定了就不用担心leakage 了。 |
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q********0
发帖数: 92 | 24 某刺激都会促使A蛋白表达增加，在刺激后，我用普通免疫荧光观察A蛋白，和GFP-A蛋
白转基因小鼠比，是不是GFP-A蛋白转基因鼠更容易观察到A蛋白的表达？ |
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D*a
发帖数: 6830 | 25 这个肯定会被要求证明GFP-A跟原来蛋白的表达各种一致，以及GFP-A跟原来的蛋白调控
各种一致的。 |
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s******a
发帖数: 472 | 26 我说的是通常的fluorescent widefield 或者 confocal显微镜，不算fancy的超分辨率
或者单分子显微镜技术。
因为细胞通常有一定的autofluorescence，一个细胞表达多少GFP分子才能使GFP荧光超
过自发荧光被检测到。 |
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H****s
发帖数: 301 | 27 I forget the source of information. It may be scientifically misleading, so
use this information at your own risk.
For GFP molecules in mammalian cells, the common ground is about 1000 GFP
molecules. Somebody ever claimed that 400 molecules were good enough. |
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z*****g
发帖数: 55 | 28 有人从组织里面用这个gfp-trap做过ip么？看他们网站上好像写的不太有信心的样子
或者哪位能推荐一个从组织里面做ip的gfp抗体么？ |
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c********b
发帖数: 363 | 29 是不是用了小鼠做的GFP抗体？换个在兔子里做的GFP抗体试试？ |
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m********2
发帖数: 317 | 30 我正在用的GFP比较暗，EGFP稍好些，但是还是比较暗。
有没有更亮的，但是没有毒性的GFP。
谢谢 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 31 这是google来的：
Douglas C. Prasher (born August 1951) is an American molecular biologist. He
is known for his work to clone and sequence the genes for the photoprotein
aequorin [1] and green fluorescent protein (GFP) [2] and for his proposal to
use GFP as a tracer molecule.[3] He communicated his pioneering work to
Martin Chalfie and Roger Y. Tsien, but by 1991 was himself unable to obtain
further research funding, and left academia. Eventually, he had to abandon
science. Chalfie and Tsien were awar... 阅读全帖 |
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w*********1
发帖数: 27 | 32 请问您可以看到在interphase的filament以及在mitosis的spindle么？我构建的GFP-
Tubulin绿色荧光超强，可就是看不到丝状结构。看上去也不是GFP，因为在间期里细胞
核没有绿色，绿色都在细胞质里面，但是就是diffuse在细胞质里，不形成微管结构，
这个让我很惆怅。 |
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d********0
发帖数: 534 | 33 GFP主要用于是基础实验，现在确实没有临床应用，但现在很多报道钱永健死讯的报道
中，很多说的好像GFP能用于临床诊断似的，这有点误导之嫌了 |
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l*****k
发帖数: 587 | 34 pre-absorption might help you, just use tumore sample without GFP to
pre-absorb your antibody before you use it on the real tissues.
you can also increase the stringency of your experimental condition, like
increase BSA concentration or Tween concentration, wash more rigorously.
I once made affinity-purified anti-RAD51 myself, however, I can't use it for
anything since it binds to a lot of other tissues. Wish you good luck |
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m****r
发帖数: 383 | 35 想改造一个tumor cell line, 加上荧光标记，以后打老鼠，可以用来看tumor
formation, 以及收集起来做flow cytometry。犹豫用什么tag 好。GFP 还是
luciferase, 或者其他？谢啦。 |
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m****r
发帖数: 383 | 36 自己顶一下。
我查了查，初步印象是，GFP荧光相对弱，不太适合用来观察deep tissue的tumor.但是
表达luciferase的tumor cell似乎不适合用来做flow cytometry,因为加底物luciferin
可能会破坏细胞。谁有经验么？ |
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p**i
发帖数: 3525 | 37 xiexie，很有道理。那如何做才是现代的最有说服力的细胞实验呢? 我们一般是加例如
GFP-tag，
然后用retroviruses转染建立几个细胞系，然后看接受信号后的蛋白移动。
inducible clones 是否比较不过时有说服力?
transient
many
one |
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g*****n
发帖数: 241 | 38 我替我们系的一个朋友问个问题，他想在zebrafish的上皮细胞特异性的表达GFP，但他
不研究zebrafish，所以不知道该到哪里找相关的zebrafish的promoter的资料。请研究
zebrafish的同僚帮忙指点一下。
谢谢 |
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a********1
发帖数: 5 | 39 我需要克隆GPF到PDONR201,请问怎么查GFP的序列阿,谢谢 |
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s******r
发帖数: 2876 | 41 clontech的pEGFP-N1有全序列。
我需要克隆GPF到PDONR201,请问怎么查GFP的序列阿,谢谢 |
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t******8
发帖数: 478 | 42 chemicon/millipore有很多anti-GFP的抗体，rabbit的，很好。我们实验室用的我不记
得产品号了，你自己去查查哪一个适合做IP，它的简介上都写有的。 |
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J********3
发帖数: 3151 | 43 恩，俺在以前的Lab也用CLONTECH 的POLYCLONAL Anti-GFP，效果很好，价格贵不贵就
忘了，当时买了3管，有的IP非常好，有的只能做WB。 |
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h******y
发帖数: 1374 | 44 有人用过GFP或者mCherry标记的LC3来观测autophagy吗？
能不能用FACS来检测autophagy |
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s*******g
发帖数: 3332 | 45 我记得好像有LC3-GFP transgenic mice
不是做这个的，不是很清楚具体细节，但是印象中听过报告 |
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z*******a
发帖数: 175 | 46 dear sunnyday,
can you please give me cat# of the GFP antibody that you are using? |
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s******y
发帖数: 28562 | 47 Related question: does the anti-GFP from sigma work for denaturing condition?
The one from abcam is not very efficient in denaturing condition when SDS is
present. |
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V**F
发帖数: 164 | 48 clontech website 说 2.5X brighter than EGFP
想在mammalian cell 里面建 promoter reporter line。
再考虑有没有必要用这个 ZsGreen1 GFP
各位有什么建议，麻烦不吝赐教啊。多谢多谢。 |
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m*****n
发帖数: 760 | 49 要rabbit的，用在mouse样品。
曾经试过invitrogen的GFP抗体，好像不怎么好用。 |
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J********3
发帖数: 3151 | 50 Clontech 的GFP抗体很好用，用过Stem cell公司的nestin的单抗，很好用。
mouse的抗体，用在mouse样品一样没问题哈。 |
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