Z******5
发帖数: 435 | 1 pll3.7通常是用来表达miRNA或者shRNA的。
最近想构建一个表达蛋白的载体，但是手上只有这套病毒系统。想问问：
1，有没有人用过这套系统表达蛋白？
2，mU6启动子应该是不能用吧，是不是要用CMV启动子，和GFP做融合表达？
3，我要表达的是一个转录因子，担心与GFP融合会影响其功能。考虑将 CMV+GFP 这段
用 CMV+外源基因+IRES+EGFP+SV40 polyA 替换掉，这样构建好的载体就有近10kb了，
会不会影响病毒包装效率？
另外再问一个我要过表达的是一个原癌基因，在安全性方面是不是要非常小心？ |
j****x
发帖数: 1704 | 2 Lentivector的包装极限在10kb左右，事实上超过6kb以上就得拼人品了。包装效率和包
装大小成几何反比，大小增加一个kb，效率就可能下降一个数量级。10kb的插入片断，
劝你不要考虑了，太碟中谍了。。。 |
r***e
发帖数: 2539 | 3 10kb是载体大小吧，病毒RNA没这么大。
你的设计没问题，注意不能有polyA signal。
会终止病毒RNA。
【在 Z******5 的大作中提到】
: pll3.7通常是用来表达miRNA或者shRNA的。
: 最近想构建一个表达蛋白的载体，但是手上只有这套病毒系统。想问问：
: 1，有没有人用过这套系统表达蛋白？
: 2，mU6启动子应该是不能用吧，是不是要用CMV启动子，和GFP做融合表达？
: 3，我要表达的是一个转录因子，担心与GFP融合会影响其功能。考虑将 CMV+GFP 这段
: 用 CMV+外源基因+IRES+EGFP+SV40 polyA 替换掉，这样构建好的载体就有近10kb了，
: 会不会影响病毒包装效率？
: 另外再问一个我要过表达的是一个原癌基因，在安全性方面是不是要非常小心？
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Z******5
发帖数: 435 | 4 多谢楼上两位。
病毒最后包装的部分应该是HIV-5'LTR到HIV-3'LTR之间的部分吧。pll3.7载体上这部分
大小是5kb，我改造后大小是6kb。我要分别构建两个转录因子的载体，一个是500bp，
另一个1.4kb。我想应该没什么问题。 |
c*********7
发帖数: 148 | |
g*********5
发帖数: 2533 | 6 you means AATAAA?
【在 r***e 的大作中提到】
: 10kb是载体大小吧，病毒RNA没这么大。
: 你的设计没问题，注意不能有polyA signal。
: 会终止病毒RNA。
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f*******e
发帖数: 354 | 7 只要把你的东西替换掉vector的东西就好了，为什么要额外加sv40和PA？
【在 Z******5 的大作中提到】
: pll3.7通常是用来表达miRNA或者shRNA的。
: 最近想构建一个表达蛋白的载体，但是手上只有这套病毒系统。想问问：
: 1，有没有人用过这套系统表达蛋白？
: 2，mU6启动子应该是不能用吧，是不是要用CMV启动子，和GFP做融合表达？
: 3，我要表达的是一个转录因子，担心与GFP融合会影响其功能。考虑将 CMV+GFP 这段
: 用 CMV+外源基因+IRES+EGFP+SV40 polyA 替换掉，这样构建好的载体就有近10kb了，
: 会不会影响病毒包装效率？
: 另外再问一个我要过表达的是一个原癌基因，在安全性方面是不是要非常小心？
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Z******5
发帖数: 435 | 8 我一开始是想把pIRES2-EGFP上的元件直接替换过去，所以就加了PolyA
不过看了楼上reuse童鞋的意见，我觉得是有道理的，所以真正做的时候就没加。
我已经把两个转录因子都分别克隆进pIRES2-EGFP了，下一步就是要用BsrG1和Nhe1切下
来，连到pll3.7中。
最近太忙了，一直扔在那没做。等我弄好了，确认能表达了，过来给大家报个信。
【在 f*******e 的大作中提到】
: 只要把你的东西替换掉vector的东西就好了，为什么要额外加sv40和PA？
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