d*2
发帖数: 35 | 1 1. 首先看GFP－LC3， LC3-II，这个你做过了
2. In vitro 处理Bafilomycin或者Chloroquine，然后再看GFP－LC3， LC－II，这个
可以知道Flux
3. 或者用RFP－GFP－LC3看Flux
4. In vivo，染色看LC－3，如果可以的话，注射Bafilomycin，再看LC－3II的WB。或
者找reporter小鼠。P62可看可不看，毕竟能提供的信息量不多。 |
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z*******9
发帖数: 112 | 2 我用Lenti-X lentiviral vector （EF-1 alpha Promoter)表达我的一个viral
glycoprotein,在其C端与GFP marker之间，我加上了一Protease 2AA site，我认为这
样只要细胞有gfp就一定有我的目标蛋白表达，
结果却不是我预测的，我在gfp表达细胞并没有监测到我的目标蛋白，
请问，各位做细胞系的大牛有何建议，谢谢 |
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C****n
发帖数: 79 | 3 看到很多大虾在谈论CRISPR，屡试不爽。这里就贴个negative 的case,请教各位专家有
没有什么好的建议。
background:
想在一个fungus里用CRISPR系统，非model system。
在该fungus中还没发现homologous recombination，so till now gene-knock-out is
not accessible.
current status:
1) Cas9 gets expressed by using GFP fused Cas9。
2)NLS works，在hyphae 中观察到 nuclear localization of GFP fused Cas9 and
NLS。 没有做western blot，因为GFP fuse 在Cas9 的 C末端，NLS 在Cas9的N末端，
这样理论上可以validate Cas9 能表达吧
2)U6 promoter，是个问题，由于该物种中U6 没有define，PCR克隆的U6 promoter不
work。根据之前大虾的建议，用了Pol II，一个version是直接... 阅读全帖 |
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c********r
发帖数: 1125 | 4
这个绝对扯的。。tjian 早被认为钙染料就可能得奖，至于GFP的话他的贡献也是刚刚
的，尽管不是第一发现者，但是后来改良工作巨大，倒是douglas prasher没得比较可
惜。
至于martin chalfie得绝对是自己宣传的好加运气，不是他克隆的基因，不是他发现的
现象，只是当时要GFP的质粒很多人人用的错的序列，他运气比较好成功了而已，能得
奖绝对是烧高香。
至于roger 在GFP那个奖里面3人的贡献我相信没人质疑。
当然这个跟他人品无关... |
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C****n
发帖数: 79 | 5 最近在用DAPI染丝状真菌的细胞核，步骤完全是照着教科书或者paper做的。突然发现
DAPI可能会导致细胞核破裂，造成了严重的fake结果。
比如without DAPI staining, 用显微镜观察NLS-GFP是细胞核定位的；但是在DAPI染色
（10min）后观察，GFP的定位变成 cytoplasmic了。然后我做了一个time elapse的实
验，很诡异的发现在某一个时间点细胞核突然间破裂了，定位在细胞核里的GFP突然
distribute to the entire hyphae。
请教各位大虾这是因为DAPI的毒性照成的吗？因为sample比较多，实在不想fix以后再
immunostaining 观察，除此之外有什么好方法吗？十分感谢！ |
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j******i
发帖数: 939 | 6 不会真的有造假吧
From Google Group
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Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide
Hi, Davide,
I tried the same plasmid that you used to target DYRK1A, HBA2, GATA4, which
are tested in Han's paper, but I didn't see any indel as they did. It seems
there is something wrong with this sy... 阅读全帖 |
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h*****G
发帖数: 113 | 7 只要是mamalian codon optimized的Cas9就可以，最好带GFP or antibiotic
selection，这样可以sort transfected的细胞。
Cas9-2A-GFP/Puro-U6/H1-gRNA的最好。
对于knock-in cassette, 如果你只是single or a few nucleotide mutation, 那么
最方便的应该是直接order single stranded DNA, 长度 ～ 100 nt. Homology arms >
40 nt 就足够了。
如果是要knockin比较大的insert，比如说GFP reporter，那么可以需要克隆到质粒上,
homology arm > 500 bp，就可以了。可以有antibiotic selection，也可以不用，取
决于你的效率。 效率低的情况用antibiotic selection，之后还需要一个step，用cre
-loxp把antibiotic selection cassette给去掉，否则在很多情况下会影响你gene的表
达。
在两种情况都要... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 8 Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide |
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发帖数: 1 | 9 From Google 网上论坛
Michael Wilson
2016-07-15 16:54（1 分钟前）
将帖子翻译为中文
Hello,
We have twice attempted to test the NgAgO addgene plasmid in HEK 293 cells
using lipofectamine transfection and the EGXXFP split reporter assay. As
many are aware, this assay requires DNA cleavage in the EGXXFP plasmid to
restore GFP expression.
We ordered oligos with 5' phosphorylation and transfected directly or PNK-
treated an aliquot prior to transfection, just to ensure 5' phosphorylation;
neither of these methods ... 阅读全帖 |
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s*********y
发帖数: 292 | 10 LZ看的很仔细，我感觉他造都不太会造。
像这种正好切掉3个nt的STOP codon的实验，实验设计的时候就不应该决定去做
GFP-RFP fusion之后FRET，GFP的能量都漏给RFP去了，不过一般GFP channel也能测到
，不会100%消失的。但还是那句话，这实验压根就不应该这么设计
总之就是水平有限，没发过大文章也搞不清楚大文章发出来之后的后果。他发文章之前
可能想着把文章搞出来评评职称、交交差，压根就没有想到发出来之后会被那么多媒体
吹到天上去，然后被那么多重复不出来的人揪着不放。现在是骑虎难下了 |
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m****a
发帖数: 270 | 11 为啥要刚好切掉3个nt？文章中的target site 在stop前面（Figure 5c,
Supplementary Figure 7）
切割后indel导致 reading frame shift，会有1/3的概率表达GFP
EGFP-linker-mRFP 的FRET效率低于0.1，mRFP的存在对GFP荧光影响不大。
而且同时给两种激发光的情况下，不需要考虑FRET效应。
从理论上说如果11%的细胞表达GFP，那么实际的编辑效率可能高达33%。
就想CK2015所说，这么高的效率插入将近2.5kb的片段，光靠两边15bp的同源臂简直天
方夜谭。除非阿狗会变魔术。 |
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n***p
发帖数: 79 | 12 http://www.sandiegouniontribune.com/news/2016/aug/31/roger-tsien-dies/
UC San Diego researcher Roger Tsien, who shared the 2008 Nobel Prize in
chemistry for helping find a more effective way to see potentially deadly
cells, died on Aug. 24th. He was 64.
Tsien died in Eugene, Oregon, according to UC San Diego Chancellor Pradeep
Khosla, who broke the news to the campus community on Wednesday.
The university said it appears that Tsien died on a bike trail. The precise
cause of his death has yet to ... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 14 借着韩春雨的光，生物版这么火。想再来跟大家探讨一下一个用流式细胞仪双荧光筛选
系统来鉴定并筛选出那种两个allele都被成功编辑的干细胞。
具体思路：
1。CRISPR-Cas9和gRNA在靶标上引入双链断裂。
2。donor模版，模版上带有两段1000bp的同源臂和突变碱基，同源臂之间带有荧光标签
（GFP，BFP，或者RFP等等），同源臂之外donor的backbone上面带有与同源臂之间不同
的荧光标签。
3。每次电转的时候转入细胞：Cas9质粒，gRNA质粒，带有GFP的donor，带有RFP的
donor（两个donor的backbone上面都带有BFP用以排除random integration）。
4。电转过后几天等细胞长到足够数量筛选细胞，GFP+/RFP+/BFP-的细胞应该就是那种
两个allele都被成功编辑的。
5。很多人担心这个荧光标签无法移出，实际上可以使用Loxp系统，筛选出来的细胞直
接过表达CRE可以把荧光标签切除，虽然会有34bp的loxp位点遗留下来，但是你可以把
这个遗留位点选在intron不影响mRNA。或者可以使用piggyBac系统做到无缝... 阅读全帖 |
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h*****G
发帖数: 113 | 15 小弟不才，被老板要求做luciferase assay测一个promoter的mutation对基因表达的影
响。
因为以前没有做过，所以向各位有经验的大侠请教，希望不吝赐教。
问题1:
luciferase assay和GFP相比有什么优势啊？如果直接在promoter后面接一个GFP，直接
FACS看GFP的表达不也可以看基因表达的变化，而且还不用任何特别的试剂盒。
问题2:
看了Thermo fisher网站上的信息，有不同版本的luciferase。比如firefly
luciferase只能表达在细胞内，需要细胞lysate，然后加入luciferin，ATP等才能测发
光。 而一些其它的版本，比如Gaussia Luciferase，可以直接分泌到media，这样不用
提lysate，可以直接测发光，方便多了，为什么还有很多实验都用的firefly的呢？
多谢指教！ |
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发帖数: 1 | 16 你的问题没有说明白啊。
在哪里表达？真核细胞里表达看显微镜，还是ecoli表达纯化蛋白？
因为我的做的蛋白质是tail anchored。所以我只干过GFP-TMD，表达量超级高。
而且你不能只表达跨膜区的20AA然后就接上了GFP，一般TMD两端边缘都有两性氨基酸，
外围有charge的氨基酸，比如KRDESC这些都要带上点作为缓冲区域，也有可能是引导如
何TMD插入ER的信号。
如果你是为了看confocal检测这段20AA是否为TMD，是否在ER上，那么信号弱就弱吧，
不重要，赶紧做其他的。
如果是在ecoli里表达，我估计会不溶，需要用periplasmic expression。如果不用，
最好接MBP，做成MBP-GFP-TMD。 |
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l******0
发帖数: 150 | 17 关于李红良团队被举报学术不端的调查意见
武汉大学学术委员会于2017年4月收到关于李红良团队在相关论文中存在学术不端
行为的匿名举报，依据《武汉大学学术不端行为查处细则》，核实了举报线索，启动了
学术调查。在此基础上，学校学术委员会责成武汉大学人民医院组织校内外专家进行调
查。
2017年12月18日，武汉大学人民医院组织包括3名校外院士组成的5人专家组对李
红良团队发表在《自然·医学》（Nature Medicine）的CFLAR和TIMBIM1两篇论文进行
了学术调查，专家组一致认为“不存在伪造科研数据的行为”。
针对2018年1月出现的新质疑，武汉大学学术委员会2018年1月26日召开主任委员
扩大会议，学术委员会主任（院士）、3名在校副主任（含1名同行院士）、1名校学术
委员会同行院士委员参加会议，另行邀请了校外7名同行专家（含2名院士）和校内2名
同行专家参加了会议。会议再次对举报内容进行了调查和质询，形成意见如下：
一、举报涉及的实验猴的申请、购买、运输、饲养以及实验全过程均有原始证明
材料和实验记录，手续齐全，没有发现造假行为。
二、举报涉及的发表在《美国科学院院报》（P... 阅读全帖 |
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w********h
发帖数: 12367 | 18 80后的华人学霸: 明天他会得诺贝尔吗?
他在中国度过童年时光，高中时便荣获 Intel 大奖。刚过而立之年的他，以光遗传学
博士论文、TALEN技术编辑基因组博后研究，以及 独立后的CRISPR/Cas9 三项里程碑式
的工作载入史册。他是张锋、华人生物学界最耀眼的新星，风投竞相追逐的对象，诺贝
尔奖的大热门。明天凌晨，他会收到来自斯德哥尔摩的电话吗？
先看看他简单的履历吧：
1983年出生中国石家庄
2004年毕业于哈佛大学化学物理专业
2009年取得斯坦福大学化学与生物工程博士
2011年加入麻省理工学院
2013年发现CRISPR/Cas系统可用来编辑DNA，使基因疗法成为可能。获得美国瓦利基金
青年研究家奖（Vallee Foundation YoungInvestigator Award），奖金 25 万美元。
2014年被《Nature》杂志评为2013年年度十大科学人物之一；获得National Science
Foundation (NSF)最高荣誉Alan T. Waterman Award，Jacob Heskel Gabbay Award in
Biotechn... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 19 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: love2000 (爱情), 信区: Biology
标 题: 长江学者论文被举报 武大:不存在学术造假行为
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jan 29 09:25:32 2018, 美东)
关于李红良团队被举报学术不端的调查意见
武汉大学学术委员会于2017年4月收到关于李红良团队在相关论文中存在学术不端
行为的匿名举报，依据《武汉大学学术不端行为查处细则》，核实了举报线索，启动了
学术调查。在此基础上，学校学术委员会责成武汉大学人民医院组织校内外专家进行调
查。
2017年12月18日，武汉大学人民医院组织包括3名校外院士组成的5人专家组对李
红良团队发表在《自然·医学》（Nature Medicine）的CFLAR和TIMBIM1两篇论文进行
了学术调查，专家组一致认为“不存在伪造科研数据的行为”。
针对2018年1月出现的新质疑，武汉大学学术委员会2018年1月26日召开主任委员
扩大会议，学术委员会主任（院士）、3名在校副主任（含1名同行院士）、1名校学术
委员会同行院士委员参加会议，另行邀请了校外7名同行... 阅读全帖 |
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m****s
发帖数: 18160 | 20 2016年5月2日，英国《自然》杂志子刊《自然 生物技术》刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文，论文负责人的英文署名是"Chunyu Han"，这篇论文在华人生物界获得广泛赞誉。论文发表的第二天，韩春雨的名字和论文在一个名为"生物艺术全球生物医学交流"的微信群里得到了热烈讨论。生命体从受精卵开始，经过不断分裂，可分化出大约60兆亿个构建人类身体的细胞，每个细胞都含有全部生命遗传信息的基因组，所谓基因组编辑技术，就是人为来调整、改变、插入、去除、修改个体或物种的基因组序列。
http://tv.cctv.com/2017/05/20/VIDEBZRf7rQNg2Y1ExpBhpQM170520.shtml
一、学界和媒体的热议Mitbbs.com
一年前，英国《自然生物技术》杂志刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文。论文的负责人"一鸣惊人"，得到了学界和媒体给予的无限荣光。在《自然》杂志社的所属期刊上发表论文，通常表明，该科研成果走在了世界科学研究的最前沿，并有可能对未来科学的发展起到关键性作用。此消息一经媒体爆出，在站内引起站内相关专业人士的热议。
国内科研水平不得了了，河北科技大学在... 阅读全帖 |
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m****s
发帖数: 18160 | 21 2016年5月2日，英国《自然》杂志子刊《自然 生物技术》刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文，论文负责人的英文署名是"Chunyu Han"，这篇论文在华人生物界获得广泛赞誉。论文发表的第二天，韩春雨的名字和论文在一个名为"生物艺术全球生物医学交流"的微信群里得到了热烈讨论。生命体从受精卵开始，经过不断分裂，可分化出大约60兆亿个构建人类身体的细胞，每个细胞都含有全部生命遗传信息的基因组，所谓基因组编辑技术，就是人为来调整、改变、插入、去除、修改个体或物种的基因组序列。
http://tv.cctv.com/2017/05/20/VIDEBZRf7rQNg2Y1ExpBhpQM170520.shtml
一、学界和媒体的热议Mitbbs.com
一年前，英国《自然生物技术》杂志刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文。论文的负责人"一鸣惊人"，得到了学界和媒体给予的无限荣光。在《自然》杂志社的所属期刊上发表论文，通常表明，该科研成果走在了世界科学研究的最前沿，并有可能对未来科学的发展起到关键性作用。此消息一经媒体爆出，在站内引起站内相关专业人士的热议。
国内科研水平不得了了，河北科技大学在... 阅读全帖 |
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s*****V
发帖数: 21731 | 22 2008年度诺贝尔化学奖得主为日本科学家下村修(OsamuShimomura)、美国科学家马丁&
amp;middot;查尔菲(MartinChalfie)和美籍华裔科学家钱永健(RogerY.Tsien)三人，他
们因“发现并发展了绿色荧光蛋白(GFP)”而共同分享了这一殊荣。
无疑，获奖的三人是当之无愧的，但对于这样一个慧及人生的项目，有两个曾在过
程中起到关键的奠基作用的人却被遗忘了。
本年度诺贝尔化学奖实际围绕荧光蛋白展开，这是一种可以发出萤光的蛋白质，日
本科学家下村修发现了绿荧光蛋白，俄罗斯的卢基扬诺夫在此基础上通过珊瑚又发现了
红色荧光蛋白(DsRed)，美国科学家道格拉斯·普莱舍(DouglasPrasher)第
一个认识到GFP可以被应用在细胞生物学中，即通过给蛋白质染色从而可以观察生物体
中各类蛋白的运动和分布。
他开始倾力研究，但在提取了编码绿色荧光蛋白的基因序列后，因为申请研究资金
未果，从而放弃了再前进一步将基因放到其他生物体内看到荧光的试验。后来查尔菲和
钱永健听说了他的工作，向他寻求绿色荧光蛋白... 阅读全帖 |
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w*********g
发帖数: 30882 | 23
日本人的诺贝尔奖计划1/5时间完成了1/3
已有 4062 次阅读 2010-10-6 21:26 |个人分类:生活点滴|系统分类:科研笔记|关键词
日本政府2000年“科学技术基本计划”中提出的目标：要在今后50年内获得30个诺贝尔
奖！并在瑞典设立了“研究联络中心”。现在过了10年，已经有10位日本人获奖，中国
人作何感想？
1 日本筑波大学的白川英树,2000年诺贝尔化学奖
2 日本名古屋大学野依良治,2001年诺贝尔化学奖
现年63岁，1938年出生于日本神户(日本公民)。1967年获京都大学博士学位。1972年
起任名古屋大学化学教授，2000年起任日本名古屋大学物质科学研究中心主任。
3 日本科学家田中耕一,2002年诺贝尔化学奖
发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法”和“发明了对生物大分子的质谱分
析法”
4 日本科学家小柴昌俊,2002年诺贝尔物理奖
东京大学初级粒子物理国际研究中心。“在天体物理学领域做出卓越贡献，尤其是他
们发现了宇宙中的微中子”。
5 日本科学家南部阳一郎,2008年诺贝尔物理奖，表彰他发现了亚原子物理的对称... 阅读全帖 |
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M*P
发帖数: 6456 | 24 一个sad story。GFP的发现者没能tenure的，即使发现了GFP这么重要的东西也拿不到
钱。
Prasher a Nobel Prize |
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M*P
发帖数: 6456 | 25 GFP很不一样吧，GFP是发现的时候没人理解这个有什么用。结果这个发现者因为没人理
解这个有什么用，结果没拿到funding，进而没拿到tenure。 |
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发帖数: 1 | 26
Download pdf published by SfN (Chapter from 'The History of Neuroscience in
Autobiography, Volume 8' edited by Larry R. Squire)
Yuh-Nung Jan's CV
Lily Jan's CV
Yuh-Nung Jan and Lily Jan
Birth
Family History and Growing Up
National Taiwan University
The Hiking Trip to Shitou in the Spring of 1967
Graduate School Application
Graduate Study at Caltech (1968锟974)
Seymour Benzer Lab (1974锟977)
Steve Kuffler锟絪 Lab at H... 阅读全帖 |
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i***a
发帖数: 11095 | 28 http://www.sciencenet.cn/blog/饶毅.htm
做出应获诺贝尔奖工作的科学家，几十年默默无闻；
被广泛应用的分子，很少人知其发现者；
原始论文鲜为人知，后继论文倒很热门；
曾失明的人，发现了美丽的发光蛋白；
低调的父亲，出了高调的儿子。
这里简介一项生物化学研究，讲一个科学家的故事，还讨论一个问题：是否活着的科学
家中还有因好奇而做科学研究？
本文和我2002年一篇文章相同，不是预测诺贝尔奖，而是介绍值得获奖的工作。名单上
不包括可以获奖、但其工作不值得获奖者。相反，本文的主人公可能被埋没得不到奖，
但他的工作很值得介绍。
生物发光和荧光蛋白
现在研究生物的人，几乎都知道绿色荧光蛋白（GFP），但常常不知或搞错其发现者。
毫无争议的发现者是日裔美国科学家下村修（Osamu Shimomura，下村脩）和已故美国
科学家约翰森（Frank H. Johnson）。他们1961到1974年发现两种发光的蛋白质：水母
素（aequorin）和GFP。
水母素
生物发光现象，下村修和约翰森之前就有人研究。萤火虫发荧光，是由荧光酶（
luciferase）作为酶催化底物 |
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q****n
发帖数: 8 | 29 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: wonewbee (wo newbee), 信区: Biology
标 题: Re: 中科院神经所2012年年会蒲慕明所长的讲话
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Jan 24 12:27:24 2013, 美东)
另一个危害就是data模糊外加选择性解读，最近的一个真事：
ucsd jin yishi lab 2009年的cell paper (汗，一座还是个中国人）；这个工作后面
有两个postdoc 和一个graduate分别开展不同方向的研究。几年来都米有进展（害人呀
！）。都发现以前的结果很难清晰再现（至少不象发表的那么黑白分明）。有一个苦逼
薄厚花了一年多时间仔细重复，还是不行。最后把一座嫩回来再重复。结论是当初用的
DsRed有非特异性，换成gfp后就没有任何区别了。当初结论完全不支持！
据说jin yishi很 “严肃” 的结论就是以后要用 gfp! 不知对这个cell paper, 这个
结论有没有后话了！ 呵呵。
老圃的话，看来还是 老虎，苍蝇还是要一起打。你说老板心里不明白吗？ |
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b*****n
发帖数: 10665 | 30 【 以下文字转载自 Dentistry 俱乐部 】
发信人: Ortho (Ortho), 信区: Dentistry
标 题: 老婆的十年和我的十三年
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Nov 5 18:25:46 2012, 美东)
老婆的十年和我的十三年
老婆在美的十年
国内口腔博士毕业，大学毕业开始学英语，日语为中学和大学的外语。
2002: 到美中西部大城市和老公团聚
2003: 博后，考牙医board I和TOEFL，成绩好得让老公倍感压力。
2004: 继续博后，上口腔生物学硕士，成功申请到本校正畸科（Orthodontics，Braces
doctor）住院医。
2005－2008：住院医期间考了board II和临床操作（CREDTS），毕业顺利拿到本州的牙
医执照和专科执照，开始找工作。
2008－至今：诊所打工，供老公上学。最近开始琢磨自己开诊所。
幸运：
1.博后老板是牙医和PhD，从不过问实验，有时间准备考试。
2. 老公申请到了绿卡
3. 只申请了一个学校的正畸科，顺利match.
建议：
1.国内牙医到美尽快上学拿执照
2.三条途径拿执照：
a.... 阅读全帖 |
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s*****V
发帖数: 21731 | 31 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: saturnV (土星五号), 信区: Military
标 题: 体制问题，天才科学家穷困潦倒学霸得奖
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Apr 23 12:17:28 2012, 美东)
2008年度诺贝尔化学奖得主为日本科学家下村修(OsamuShimomura)、美国科学家马丁&
amp;middot;查尔菲(MartinChalfie)和美籍华裔科学家钱永健(RogerY.Tsien)三人，他
们因“发现并发展了绿色荧光蛋白(GFP)”而共同分享了这一殊荣。
无疑，获奖的三人是当之无愧的，但对于这样一个慧及人生的项目，有两个曾在过
程中起到关键的奠基作用的人却被遗忘了。
本年度诺贝尔化学奖实际围绕荧光蛋白展开，这是一种可以发出萤光的蛋白质，日
本科学家下村修发现了绿荧光蛋白，俄罗斯的卢基扬诺夫在此基础上通过珊瑚又发现了
红色荧光蛋白(DsRed)，美国科学家道格拉斯·普莱舍(DouglasPrasher)第
一个认识到GFP可以被应用在细胞生物学中，即通过... 阅读全帖 |
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d********f
发帖数: 43471 | 32 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: mahmet (里约大冒险), 信区: Biology
标 题: 知识分子独家专访：面对质疑的韩春雨
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Oct 17 21:05:25 2016, 美东)
独家专访：面对质疑的韩春雨
原创2016-10-18 陈晓雪、李晓明 知识分子
►韩春雨任教的河北科技大学门口。摄影：陈晓雪
内文提要：
独家专访：面对质疑的韩春雨
韩春雨NgAgo论文可重复性争议考验科学界
编者按：
5月初，《知识分子》以国际科学媒体的标准，第一时间报道依据国际科学同行
评议的学术刊物上发表的韩春雨论文以及当时多位科学家评论，并说明其是发展了荷兰
科学家的工作。此后，国内媒体和单位纷纷跟进，因为没有新的工作进展，《知识分子
》未继续报道。从网上开始有声音质疑韩春雨文章结果，《知识分子》一直保持追踪国
内外学术界最新的动态，但不依据私下匿名来源为主作报道，直到13位中国科学家公开
实名发言后，《知识分子》才有可以较为完整、公开的事实可以报道。
NgAgo实验的可重复性争议历经数月之... 阅读全帖 |
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c******n
发帖数: 16666 | 33 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: mitbbs (未名空间), 信区: Biology
标 题: Mitbbs水平挺高的，纯从科学家角度质疑韩春雨
发信站: BBS 未名空间站 (Sun May 21 23:40:17 2017, 美东)
2016年5月2日，英国《自然》杂志子刊《自然 生物技术》刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文，论文负责人的英文署名是"Chunyu Han"，这篇论文在华人生物界获得广泛赞誉。论文发表的第二天，韩春雨的名字和论文在一个名为"生物艺术全球生物医学交流"的微信群里得到了热烈讨论。生命体从受精卵开始，经过不断分裂，可分化出大约60兆亿个构建人类身体的细胞，每个细胞都含有全部生命遗传信息的基因组，所谓基因组编辑技术，就是人为来调整、改变、插入、去除、修改个体或物种的基因组序列。
http://tv.cctv.com/2017/05/20/VIDEBZRf7rQNg2Y1ExpBhpQM170520.shtml
一、学界和媒体的热议Mitbbs.com
一年前，英国《自然生物技术》杂志刊载了一篇有关"基因编辑工具"的... 阅读全帖 |
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o*****s
发帖数: 1445 | 34 state u里面的战斗机，OSU校友的悲惨一生：就像华理美东校友会说的，education
does matter
发信人: ency (旺财｜生的委琐 活的憋屈), 信区: Biology
标 题: 普瑞舍痛失诺贝尔奖，唉
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Oct 27 16:04:21 2008)
本年度的诺贝尔化学奖颁给了三位发现水母荧光蛋白的美国科学家。但是，
发现这种蛋白质基因并把它给了这些诺贝尔获奖者的科学家，已经不再在这个领
域工作。他现在是一名开大巴的司机。
道格拉斯. 普瑞舍，生于1951年8月，是美国的分子生物学家。他最早对绿
色荧光蛋白基因(GFP)进行了克隆和测序，也是他最先建议用这种绿色荧光蛋白
作为示踪分子。
普瑞舍于1979年在美国俄亥俄州立大学获得生物化学博士学位。从1979年到
1983年，他在佐治亚大学研究遗传学和生物化学，在那里他发现了水母发光蛋白。
随后，他到马萨诸塞州伍兹霍尔海洋研究所生物系研究生物荧光现象。1988年，
他获得了美国癌症协会三年20万美元的研究经费，试图克隆基因的绿色荧光蛋白
(GFP)，正是这种蛋白质使水母可以发光。 |
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d*****r
发帖数: 2583 | 35 ☆─────────────────────────────────────☆
xlow (low) 于 (Mon Feb 23 00:52:33 2009) 提到:
如果想lively地trace一些有某个RNA特异表达的细胞，有没有什么比较成熟的方法？
我看到有人利用一段RNA 通过二级结构和一个蛋白的特异结合，然后通过fusion了GFP
的这个蛋白来marK RNA的位置， 但是背景很高，在整个细胞的level上估计根本看不清
楚。。。
不知道各位见过／听说过别的方法啊。。谢了。。。
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sunnyday (艳阳天) 于 (Mon Feb 23 01:09:18 2009) 提到:
就是这个方法。在细胞水平上要看到没有问题。
GFP
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ahche (啊且) 于 (Mon Feb 23 01:27:43 2009) 提到:
MS2 or lambda-N are still the most po |
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D***a
发帖数: 516 | 36 用293T细胞，转lentivirus病毒载体和gagpal+vsvg,产生的病毒是不是有一部分又感染
回到293T了？那这个会增加病毒产率（比如说感染回去，vector又可以被复制，产生新
的病毒）还是降低病毒产率（病毒被消耗掉了）？
我的一个shRNA病毒产量总是很低（一个是共转染之后293T荧光少（载体含GFP），另一
个是病毒infect target cell后筛选，得到的克隆少得多），跟control和另外一个
gene family isoform相比。我做了不加gagpal和vsvg,把载体单独转到293T里面，从
GFP荧光看plasmid质量没问题，跟control是一样的。查到有文章提到这个蛋白可以帮
助病毒entry，是不是就是病毒低的原因呢？
谢谢大家。 |
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g******g
发帖数: 63 | 37 偶研究夫人是microRNA的lentiviral vector
GFP是vector的标记蛋白
请问
1.现今有任何方法可以测试细胞中被knock down 或者know in 的microRNA的
expression吗？QRTPCR不行。
2.为什么在转染几周后，GFP的表达和刚刚转染的时候的表达强度下降30%-40%？
谢谢 |
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e********r
发帖数: 147 | 38 在细菌里做，打算用超离心分别分离外膜、周质和细胞质蛋白，然后用Western杂交，
这个策略分析蛋白定位的问题会遭到审稿人的反驳吗？感觉好象细菌里用GFP来定位的
研究不是很多啊，不象在真核里只要说定位，好象就是GFP似的？ |
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m****M
发帖数: 360 | 39 I transfected cells with linearized CMV promoter driven GFP, and GFP was
expressed at high level for over one weeks (until I tossed them). They are
pretty stable in cells, is not that easy to be degraded (DNA or protein). It
's easy to test that, just cut off the ORF and transfect it. |
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z********i
发帖数: 610 | 40 没有接触过virus infection。
转染后24小时换液，24后收virus（2ml)，因为没有超速离心机，所以没法浓缩。测试
的时候用hela，60mmdish +200ulvirus,通过GFP判断infection效率相当高。
然后用1ml/well virus 感染mouse ES cell（6 well)，发现根本没有GFP
pgk promoter，6 ug/ml polybrene
不知道那位大侠能给点意见？
谢了先 |
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e*r
发帖数: 103 | 41 流式能分辨GFP强弱吗？比如溶液里有的细胞带强GFP有的弱。 |
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h********0
发帖数: 944 | 42 比如一些荧光蛋白如GFP会淬灭，有没有办法解决这个问题。我需要OVERNIGHT记录GFP
的表达变化。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 43 Aves, Chick-GFP antibody works great, Roch/invitro Rabbit GFP works too... |
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p******i
发帖数: 1092 | 44 中间加linker有时候是为了防止后加上的TAG影响原来蛋白的功能
可以参考pcDNA6.2 fusion GFP系列的linker
不过以前貌似很多人都是直接加个GFP…… |
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f**********s
发帖数: 1415 | 45 I plan to transfect GFP-fused target protein to my cell line and establish
stable cell line. I am wondering if there is neccessary to include negative
control (like salmon sperm DNA) or positive control (vector without encoding
GFP or target protein) during the transfection and selection process.
Thanks!
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m*****n
发帖数: 760 | 46 本人对siRNA的设计和应用几乎无知，问题比较菜，请大家不要见笑。
需要用siRNA来knockdown一个外源表达的fusion protein(GFP-GOI)，
因为不想影响endogenous GOI，所以想请教能不能设计siRNA只针对GFP，而不是GOI？
这样的siRNA会有效果吗？
另外大家都用什么program来设计siRNA，另外在哪家公司买siRNA啊？
谢谢了。 |
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a***e
发帖数: 1010 | 47 I guess you can silence GFP-GOI transgene by only targeting GFP region
without affecting endogenous GOI expression. |
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H****H
发帖数: 11039 | 48 外源表达的干嘛需要knockdown啊？
你不转到细胞里不就行了么？
要用siRNA knockdown GFP-GOI而不影响GOI表达当然可以做到，设计target GFP序列的
siRNA就可以了。 |
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O******e
发帖数: 4845 | 49 他应该是想用siRNA去除GFP-GOI to verify their GFP signals (localization
pattherns, maybe?). |
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m*****n
发帖数: 760 | 50 we want to determine if the phenotypes of the transgenic animals
are specifically caused by GFP-GOI transgene.
if by knocking down GFP-GOI transgene only, but not endougeneous GOI,
the phenotypes are gone or less severe, then we are more confident that
ectopic expression of GOI induces the phenotypes. |
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