e****p
发帖数: 354 | 1 做Northern blot， 看到清楚的目的条带，
但18S 28S位置上的有很强信号，查了PROBE并无太大同源性，PROBE 1400BP大小，用的
20ugTOTAL RNA
重复做了还是这样，有没有遇到这样的情况。有什么好办法?
多谢各位大虾 。。 |
h******u
发帖数: 131 | |
e****p
发帖数: 354 | |
h******u
发帖数: 131 | 4 一种柱子，从公司买的。如果你的基因有homologue, 或者多个isoform. 也有可能出现
这种情况。 |
n*****e
发帖数: 119 | 5 可以用kit把大部分rRNA去除。看看能不能增强信号。 |
e****p
发帖数: 354 | |
c******y
发帖数: 148 | 7 我也出现过这种情况
别人这么给我解释的，
如果你是用PCR产物做的探针,PCR的模板来自基因组的话，可能就会把一些28s 18s 基
因片段非特异扩增下来，然后被标记，而28 18RNA的量很大，所有会有信号
解决办法:
1， 使用来自质粒酶切的片段标探针
2，PCR纯化探针后，稀释1000做模板，换另一对内部引物继续PCR，纯化
3，合成oligo片段 |
w***z
发帖数: 1158 | 8 也碰到过这个问题。
用质粒做模板标记探针，针对同一基因做了2条探针，其中一条探针blot后只有特异条
带，但另一条除了特异条带外，18 28S也都有。总RNA和mRNA都试过，结果相似。 |
d******u
发帖数: 178 | 9 这个如果是直接用PCR产物标记作探针挺常见。我们是把扩增片段克隆到pGEM-T里面，
用酶切产物作探针，基本解决问题。 |
e****p
发帖数: 354 | 10 DADIAYOU 我问一下质粒酶切后还做用P32 DCTP做PCR 吧
cheerfly 割胶回收后PCR产物做探针，PCR的模板是CDNA，用OLIGODT 反转录的话，为
什么还会28 18S 污染呢？
WWWWLZ质粒做模板还是会有这种现象，你的建议是什么呢？还是探针位点问题？
非常感谢！ |
d******u
发帖数: 178 | 11 质粒酶切后a-P32 CTP+Klenow标记 |
c******y
发帖数: 148 | 12 模板是cDNA，
1，cDNA合成之前是否用Dnase I 消化
2，RNA降解途径或者RNA processing过程中会出现polyA加尾现象，我了解的至少植物
叶绿体的RNA的存在这种现象，刚google下，似乎哺乳动物也存在这种异常的加尾，用
oligodT反转录有可能会产生rRNA的cDNA
3 质粒做模板
miniprep的时候是否有痕量的大肠杆菌的基因组污染？
建议放弃PCR做模板，
酶切质粒，或者合成oligo探针
1，2，3的解释也仅仅是个人猜测了
【在 e****p 的大作中提到】
: DADIAYOU 我问一下质粒酶切后还做用P32 DCTP做PCR 吧
: cheerfly 割胶回收后PCR产物做探针，PCR的模板是CDNA，用OLIGODT 反转录的话，为
: 什么还会28 18S 污染呢？
: WWWWLZ质粒做模板还是会有这种现象，你的建议是什么呢？还是探针位点问题？
: 非常感谢！
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e****p
发帖数: 354 | |
