s******a
发帖数: 472 | 1 I used Amersham Direct Labeling Kit for my southern blot, and the protocol
is basically the kit manual. However, I have now a reproducible problem. As
shown in the blot, I expect a specific band in digested genomic DNA, but all
I have is a big smear (inside which there seems to be a band higher than my
target band).
I might have at least two problems:
1, the probe is bad;
2, the digestion is incomplete;
I kindly ask you to give me some advice regarding trouble shooting and how
should I proceed.
Take a bow... |
I***a
发帖数: 13467 | |
O******e
发帖数: 4845 | 3 多半是消化不彻底。DNA量不要加太多。
As
all
my
【在 s******a 的大作中提到】
: I used Amersham Direct Labeling Kit for my southern blot, and the protocol
: is basically the kit manual. However, I have now a reproducible problem. As
: shown in the blot, I expect a specific band in digested genomic DNA, but all
: I have is a big smear (inside which there seems to be a band higher than my
: target band).
: I might have at least two problems:
: 1, the probe is bad;
: 2, the digestion is incomplete;
: I kindly ask you to give me some advice regarding trouble shooting and how
: should I proceed.
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I***a
发帖数: 13467 | |
s******a
发帖数: 472 | 5 目前这个探针有１１００bp，太长了，不知道有没有关系。
我准备尝试几个１５０-３００bp左右的探针
【在 IDjia (ID甲) 的大作中提到: 】 |
s******a
发帖数: 472 | 6 这次DNA用的是１０ug（以前也试过５ug和１０ug）
１０ug DNA １００ ul体系切，precipitate之后上样也是类似结果（big smear，
with strongest part higher than desired）
有什么方法可以保证尽可能切好吗？
【在 O******e 的大作中提到】
: 多半是消化不彻底。DNA量不要加太多。
:
: As
: all
: my
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a******8
发帖数: 56 | 7 The amount of DNA is ok.
You are right that the probe is too long. Try using short and specific
probes.
Wash your membrane with more stringent buffer as there are dots on your
membrane.
Finally, genomic DNA quality can be a concern. Avoid votex during extraction
and frequent freeze/thaw cycles.
Good luck. |
O******e
发帖数: 4845 | 8 probe为什么要那么长？太夸张了
【在 s******a 的大作中提到】
: 目前这个探针有１１００bp，太长了，不知道有没有关系。
: 我准备尝试几个１５０-３００bp左右的探针
: 【在 IDjia (ID甲) 的大作中提到: 】
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b*****o
发帖数: 150 | 9 切割不完全 破酶烂DNA
As
all
my
【在 s******a 的大作中提到】
: I used Amersham Direct Labeling Kit for my southern blot, and the protocol
: is basically the kit manual. However, I have now a reproducible problem. As
: shown in the blot, I expect a specific band in digested genomic DNA, but all
: I have is a big smear (inside which there seems to be a band higher than my
: target band).
: I might have at least two problems:
: 1, the probe is bad;
: 2, the digestion is incomplete;
: I kindly ask you to give me some advice regarding trouble shooting and how
: should I proceed.
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s******a
发帖数: 472 | 10 一言难尽啊
实验室有另外一个高年级PHD，做和我类似的课题。
刚进实验室是他带我。他坚持认为越长越特异。所以我设计探针都按他建议的长度设计。
由于结果一直是smear，我就和他探讨是不是probe太长，非特异结合的可能性也大。
他直接否定我的想法，还是认为越长越好。
题外话，他基本从来没有肯定过我的想法。。。
【在 O******e 的大作中提到】
: probe为什么要那么长？太夸张了
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b*****o
发帖数: 150 | 11 我觉得是这样的
Genomic DNA如果不干净 在酶切体系中是很粘的一个球 没有彻底溶解 pacI(切8bp位点
很少) 很有可能没法进入球的内部 导致不完全消化DNA
对于一般6bp的酶 因为位点比较多 酶一边切割表面的DNA 一边会帮助DNA溶解 所以酶
可以渗透到酶的内部 切割会很完全 不会有类似的问题
我建议你用pacI和一个不影响这个位点pattern的6bp酶来一起切 就不会有这个问题了
PS 我最多的时候一年做50个southern p32的哦 呵呵 不堪回首啊 |
s******a
发帖数: 472 | 12 Thanks for your detailed explanation. I will check what enzymes I can use
for this purpose.
PS: You mean 50 experiments, not samples...right? That's indeed a lot.
【在 b*****o 的大作中提到】
: 我觉得是这样的
: Genomic DNA如果不干净 在酶切体系中是很粘的一个球 没有彻底溶解 pacI(切8bp位点
: 很少) 很有可能没法进入球的内部 导致不完全消化DNA
: 对于一般6bp的酶 因为位点比较多 酶一边切割表面的DNA 一边会帮助DNA溶解 所以酶
: 可以渗透到酶的内部 切割会很完全 不会有类似的问题
: 我建议你用pacI和一个不影响这个位点pattern的6bp酶来一起切 就不会有这个问题了
: PS 我最多的时候一年做50个southern p32的哦 呵呵 不堪回首啊
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l**********1
发帖数: 5204 | 13 把他做了 或阉了 误导你呢 by SB/NB probe 越长越特异
that 1100 bp probe 1/8 length is enough for SB/NB if that region is
special
计。
【在 s******a 的大作中提到】
: 一言难尽啊
: 实验室有另外一个高年级PHD，做和我类似的课题。
: 刚进实验室是他带我。他坚持认为越长越特异。所以我设计探针都按他建议的长度设计。
: 由于结果一直是smear，我就和他探讨是不是probe太长，非特异结合的可能性也大。
: 他直接否定我的想法，还是认为越长越好。
: 题外话，他基本从来没有肯定过我的想法。。。
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s******a
发帖数: 472 | 14 这个有点难度
：）
【在 l**********1 的大作中提到】
: 把他做了 或阉了 误导你呢 by SB/NB probe 越长越特异
: that 1100 bp probe 1/8 length is enough for SB/NB if that region is
: special
:
: 计。
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l**********1
发帖数: 5204 | 15 that is joke
就让他 赔你 一盒 韩国泡菜 亚洲食品店里的
【在 s******a 的大作中提到】
: 这个有点难度
: ：）
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s********n
发帖数: 2939 | 16 manual里没有建议的probe长度？这是P32标记的？ |
h******y
发帖数: 351 | 17 探针的长度最好在300-800bp，1100bp的探针太长了。
探针的选择也很重要，不要有太多重复或者low complexity的区域。
you can use this website to search for the best probe.
http://www.genes2cognition.org/software/southern_blot/
【在 s******a 的大作中提到】
: 目前这个探针有１１００bp，太长了，不知道有没有关系。
: 我准备尝试几个１５０-３００bp左右的探针
: 【在 IDjia (ID甲) 的大作中提到: 】
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s******a
发帖数: 472 | 18 manual建议３００bp是“good”，至少５０bp以上。
【在 s********n 的大作中提到】
: manual里没有建议的probe长度？这是P32标记的？
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s******a
发帖数: 472 | 19 太感谢，我之前也就是主观选择区域，blast一下。之后我设计探针的时候可以参考这
个工具。
【在 h******y 的大作中提到】
: 探针的长度最好在300-800bp，1100bp的探针太长了。
: 探针的选择也很重要，不要有太多重复或者low complexity的区域。
: you can use this website to search for the best probe.
: http://www.genes2cognition.org/software/southern_blot/
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