m******i
发帖数: 73 | 1 最近做的课题需要鉴别样品内的细菌变化,
据说16s rRNA sequencing 可以实现这个目的.
google后发现了两种: PCR-DGGE 或者 16s rRNA pyrosequencing.
好像还有用 mircoarray 什么的.
请问16s rRNA pyrosequencing 好做吗? 做一个样品要多少钱, 多长时间?
数据好分析吗?
老板说很难做. 我不是生物背景, 恳请板上大牛给科普一下.
不胜感激. |
t*d
发帖数: 1290 | 2 未知菌还是已知菌？
已知菌的话，如果菌不多，用几个pcr 不就可以了么？
如果多，点张个芯片，也很快，而且便宜。
如果有未知菌，只能测序了。不过如果菌不多，常规测序就可以了吧。
NGS 在metagenomcis 中的应用可能和你的需求有点相似。
【在 m******i 的大作中提到】
: 最近做的课题需要鉴别样品内的细菌变化,
: 据说16s rRNA sequencing 可以实现这个目的.
: google后发现了两种: PCR-DGGE 或者 16s rRNA pyrosequencing.
: 好像还有用 mircoarray 什么的.
: 请问16s rRNA pyrosequencing 好做吗? 做一个样品要多少钱, 多长时间?
: 数据好分析吗?
: 老板说很难做. 我不是生物背景, 恳请板上大牛给科普一下.
: 不胜感激.
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m******i
发帖数: 73 | 3 感谢!
粪便样品,想知道哪些肠内细菌变化了,应该是菌很多的情况吧.
我们不知道哪些会变化.
这种情况该如何入手?
再次感谢!
【在 t*d 的大作中提到】
: 未知菌还是已知菌？
: 已知菌的话，如果菌不多，用几个pcr 不就可以了么？
: 如果多，点张个芯片，也很快，而且便宜。
: 如果有未知菌，只能测序了。不过如果菌不多，常规测序就可以了吧。
: NGS 在metagenomcis 中的应用可能和你的需求有点相似。
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t*d
发帖数: 1290 | 4 这个估计只能芯片或者NGS了。
芯片的难处在设计探针。探针设计完以后，操作比较简单些，便宜。NGS 的难处在建库
，操作比较复杂。
总的说来，NGS 可能更适合些。
【在 m******i 的大作中提到】
: 感谢!
: 粪便样品,想知道哪些肠内细菌变化了,应该是菌很多的情况吧.
: 我们不知道哪些会变化.
: 这种情况该如何入手?
: 再次感谢!
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d***y
发帖数: 8536 | |
m******i
发帖数: 73 | 6 你的意思是:
找一个识别16s RNA sequence 某个区域的通用引物.
然后PCR, 再然后测这些放大的序列 (可能有几百种菌).
我的理解对吗?
【在 d***y 的大作中提到】
: 找对通用引物，P完了去测序不就得了。
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m******i
发帖数: 73 | 7 请问有没有公司的商业化芯片?
或者哪个公司能提供测序的服务?
另外您说的NGS建库指的什么? 我最简单的理解是测了序列之后,
和数据库比对, 就可以知道哪些变化了,请继续科普.
多谢多谢.
另外,我找到了一片相关的
http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.p
【在 t*d 的大作中提到】
: 这个估计只能芯片或者NGS了。
: 芯片的难处在设计探针。探针设计完以后，操作比较简单些，便宜。NGS 的难处在建库
: ，操作比较复杂。
: 总的说来，NGS 可能更适合些。
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r*********r
发帖数: 6 | 8 “细菌变化”到底是指细菌种类的变化，还是数量的变化？
由于你的样品是许多混合的细菌，所以不能直接以SANGER法测序混杂的PCR产物。可以
用DGGE、SSCP、克隆、或pyrosequencing等方法，各有利弊，具体要看你想解决什么问
题。
【在 m******i 的大作中提到】
: 最近做的课题需要鉴别样品内的细菌变化,
: 据说16s rRNA sequencing 可以实现这个目的.
: google后发现了两种: PCR-DGGE 或者 16s rRNA pyrosequencing.
: 好像还有用 mircoarray 什么的.
: 请问16s rRNA pyrosequencing 好做吗? 做一个样品要多少钱, 多长时间?
: 数据好分析吗?
: 老板说很难做. 我不是生物背景, 恳请板上大牛给科普一下.
: 不胜感激.
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t*d
发帖数: 1290 | 9 不知道有没有商业化的。你可以查查Affy 的 phylochip，还有其他的一些panchip，
greenchip，MDA等等。不过这些芯片都有些年纪了，可能赶不上现在的形势了（越来越
多的细菌被测序）。
对于 NGS 建库，我指的是吧16s RNA 序列变成测序仪器可用的DNA 短片段之间的操作
过程。可以问问 BGI 接不接这个活吧。版上不是有 BGI 的兄弟么。
【在 m******i 的大作中提到】
: 请问有没有公司的商业化芯片?
: 或者哪个公司能提供测序的服务?
: 另外您说的NGS建库指的什么? 我最简单的理解是测了序列之后,
: 和数据库比对, 就可以知道哪些变化了,请继续科普.
: 多谢多谢.
: 另外,我找到了一片相关的
: http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.p
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m******i
发帖数: 73 | 10 我们都想知道:
细菌种类的变化
还有数量的变化
我上次听了一个seminar, 他们用的是 pyrosequencing,
我老板说得到数据不困难, 困难在如何分析解释上.
您能不能给科普一下大致的过程,难点和相关信息.多谢
【在 r*********r 的大作中提到】
: “细菌变化”到底是指细菌种类的变化，还是数量的变化？
: 由于你的样品是许多混合的细菌，所以不能直接以SANGER法测序混杂的PCR产物。可以
: 用DGGE、SSCP、克隆、或pyrosequencing等方法，各有利弊，具体要看你想解决什么问
: 题。
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m******i
发帖数: 73 | 11 请问探针设计的难度主要在哪里?
如果知道了序列,找出特异性的20-40碱基序列是不是就可以了呢?
如果这个可行,可以尝试着自己设计序列,然后找公司做芯片.
因为我们可能只关注几百到1000个种类.
【在 t*d 的大作中提到】
: 这个估计只能芯片或者NGS了。
: 芯片的难处在设计探针。探针设计完以后，操作比较简单些，便宜。NGS 的难处在建库
: ，操作比较复杂。
: 总的说来，NGS 可能更适合些。
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l******n
发帖数: 520 | 12 16S rDNA amplicon sequencing |
t*d
发帖数: 1290 | 13 这个探针设计比较麻烦。
1）细菌16s RNA 的同源性很高，经常找不到非常特异的碱基序列。
2）芯片的分辨率不高，序列差异不太明显的话（比如相似性 > 80%)，可能都会出杂交
信号。
3）由于目标序列相似性太高，对于杂交条件要求比较严格，需要微调杂交液的组分、
杂交温度等参数。可是不同的探针适用的最佳杂交条件会有差异，所以设计探针的目标
之一是通过使用最少的探针来达到最大的分辨力。这时需要设计组合探针，最后通过几
十个探针的信号的来判读几千个菌种。
4）设计探针最好针对全长序列设计，但是NCBI数据中只有一部分所有的细菌的16s RNA
全长序列。
【在 m******i 的大作中提到】
: 请问探针设计的难度主要在哪里?
: 如果知道了序列,找出特异性的20-40碱基序列是不是就可以了呢?
: 如果这个可行,可以尝试着自己设计序列,然后找公司做芯片.
: 因为我们可能只关注几百到1000个种类.
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m******i
发帖数: 73 | 14 虽然我的问题都很初级, 太感谢您的解答了.
探针设计,看来很复杂的东西, 比如说我想看1000个细菌, 如果
已知到他们的序列 (每个大概 3-400碱基序列),这种情况下,一般
您觉得需要多少个探针呢? 一般需要几个探针来确定一个细菌呢?
如果已知序列, 有没有什么软件,可以优化探针的设计?
另外的话,如果我们做454 pyrosequencing, 测序中心
给我的数据是什么格式的? 是fasta还是其他的呢?
是不是也会给出primer和barcode 的序列?
如果这些都有了, 有没有什么软件能比较样品组之间的细菌种类和强度的差别.
我听说有个东西叫Mothur,不知是干这个用的吗?
很抱歉,太多的问题,好不容易逮着您这个懂行的.
RNA
【在 t*d 的大作中提到】
: 这个探针设计比较麻烦。
: 1）细菌16s RNA 的同源性很高，经常找不到非常特异的碱基序列。
: 2）芯片的分辨率不高，序列差异不太明显的话（比如相似性 > 80%)，可能都会出杂交
: 信号。
: 3）由于目标序列相似性太高，对于杂交条件要求比较严格，需要微调杂交液的组分、
: 杂交温度等参数。可是不同的探针适用的最佳杂交条件会有差异，所以设计探针的目标
: 之一是通过使用最少的探针来达到最大的分辨力。这时需要设计组合探针，最后通过几
: 十个探针的信号的来判读几千个菌种。
: 4）设计探针最好针对全长序列设计，但是NCBI数据中只有一部分所有的细菌的16s RNA
: 全长序列。
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m******i
发帖数: 73 | 15 请问得到数据好如何处理?
老板说得到数据没问题,
但是我们不知道处理数据的流程是什么样子的.
您能否科普一二?
谢谢.
【在 l******n 的大作中提到】
: 16S rDNA amplicon sequencing
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t*d
发帖数: 1290 | 16 16s RNA 的序列大概 1.6k 左右吧。如果过只有400左右多序列信息，很难设计探针。
比如说跟据A 菌的序列设计了一个探针 x，而且这个探针和 B 菌的400bp的序列不匹配
。但是我们不能说 探针x 和 B 菌不会杂交，因为也许探针x 和B菌的未知序列能匹配
上。所以探针 x 对于 B 菌就没有判读能力了。
测序最后拿到手的数据格式并不重要，因为肯定有方法转换成你想要的数据格式，这个
一点都不难。不过我对 NGS 的 metagenomics 不懂，希望班上牛人可以讲讲这方面的
东东。
【在 m******i 的大作中提到】
: 虽然我的问题都很初级, 太感谢您的解答了.
: 探针设计,看来很复杂的东西, 比如说我想看1000个细菌, 如果
: 已知到他们的序列 (每个大概 3-400碱基序列),这种情况下,一般
: 您觉得需要多少个探针呢? 一般需要几个探针来确定一个细菌呢?
: 如果已知序列, 有没有什么软件,可以优化探针的设计?
: 另外的话,如果我们做454 pyrosequencing, 测序中心
: 给我的数据是什么格式的? 是fasta还是其他的呢?
: 是不是也会给出primer和barcode 的序列?
: 如果这些都有了, 有没有什么软件能比较样品组之间的细菌种类和强度的差别.
: 我听说有个东西叫Mothur,不知是干这个用的吗?
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m******i
发帖数: 73 | 17 那比如说设计多个探针来检测同一个细菌, 假设我有 X,Y,Z 三个探针同时针对A,
只有全部结合,才算识别A. 这样的话,会降低误判的可能. 当然效率也低.
但如果只关注几百的细菌的话, 有无可能呢?
谢谢
【在 t*d 的大作中提到】
: 16s RNA 的序列大概 1.6k 左右吧。如果过只有400左右多序列信息，很难设计探针。
: 比如说跟据A 菌的序列设计了一个探针 x，而且这个探针和 B 菌的400bp的序列不匹配
: 。但是我们不能说 探针x 和 B 菌不会杂交，因为也许探针x 和B菌的未知序列能匹配
: 上。所以探针 x 对于 B 菌就没有判读能力了。
: 测序最后拿到手的数据格式并不重要，因为肯定有方法转换成你想要的数据格式，这个
: 一点都不难。不过我对 NGS 的 metagenomics 不懂，希望班上牛人可以讲讲这方面的
: 东东。
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t*d
发帖数: 1290 | 18 恩，你的方法可以降低误判的可能，但是无法消除误判的可能。
极端情况，A 菌的400bp在16sRNA的5'，B菌的400bp在3' 。这样针对A 的3条探针还是
可能都会和 B 菌的16sRNA 的5’匹配。
【在 m******i 的大作中提到】
: 那比如说设计多个探针来检测同一个细菌, 假设我有 X,Y,Z 三个探针同时针对A,
: 只有全部结合,才算识别A. 这样的话,会降低误判的可能. 当然效率也低.
: 但如果只关注几百的细菌的话, 有无可能呢?
: 谢谢
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m******i
发帖数: 73 | 19 是啊,消除不了误判阿.
那个phylochip是原理上怎么弄的呢?
他们自称可以识别几万种细菌, 他们还有个公司提供服务.
【在 t*d 的大作中提到】
: 恩，你的方法可以降低误判的可能，但是无法消除误判的可能。
: 极端情况，A 菌的400bp在16sRNA的5'，B菌的400bp在3' 。这样针对A 的3条探针还是
: 可能都会和 B 菌的16sRNA 的5’匹配。
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t*d
发帖数: 1290 | 20 我也不是很清楚 phylochip 怎么弄的。可能只做那些已有全长 16sRNA 的菌吧。有全
长或接近全长16sRNA的菌现在应该有好几十万株了。
另外，phylochip 也许不一定鉴定到种、亚种，也许鉴定到属就可以了？
【在 m******i 的大作中提到】
: 是啊,消除不了误判阿.
: 那个phylochip是原理上怎么弄的呢?
: 他们自称可以识别几万种细菌, 他们还有个公司提供服务.
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t*m
发帖数: 4414 | 21 why look at rRNA, not rDNA?
有个 "second genome" 公司，干这个。
meta-genome seq, 找 BGI
【在 m******i 的大作中提到】
: 你的意思是:
: 找一个识别16s RNA sequence 某个区域的通用引物.
: 然后PCR, 再然后测这些放大的序列 (可能有几百种菌).
: 我的理解对吗?
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m******i
发帖数: 73 | 22 测的是16S rRNA 的DNA序列?
【在 t*m 的大作中提到】
: why look at rRNA, not rDNA?
: 有个 "second genome" 公司，干这个。
: meta-genome seq, 找 BGI
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t*m
发帖数: 4414 | 23 yes. sequencing rDNA
【在 m******i 的大作中提到】
: 测的是16S rRNA 的DNA序列?
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C*******e
发帖数: 4348 | 24 这个就是pyrotag sequencing
只不过pyrotag sequencing的通用引物上还放了barcode
【在 d***y 的大作中提到】
: 找对通用引物，P完了去测序不就得了。
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m******i
发帖数: 73 | 25 请问放barcode序列是用来干什么?
数据处理时区分样品?
【在 C*******e 的大作中提到】
: 这个就是pyrotag sequencing
: 只不过pyrotag sequencing的通用引物上还放了barcode
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C*******e
发帖数: 4348 | 26 对，就是用来区分样品的
另外也方便分拣出你的序列
比如有时候可以两个样品一起测
但是barcode不一样后期还是可以区分开来
【在 m******i 的大作中提到】
: 请问放barcode序列是用来干什么?
: 数据处理时区分样品?
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m******i
发帖数: 73 | 27 哦,原来是这样, 多谢.
那测完序的话, 他们会告诉你primer和barcode的序列,
然后,你就可以找出那些来自细菌的序列了,
但是,可不可能有相同序列来自多个测序片段, 如有, 那该怎么办呢?
另外,对测出来的序列,是不是有一定长度要求,比如说,50个碱基以下不考虑.
不好意思,问题太多,太蠢, 请多包含.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 对，就是用来区分样品的
: 另外也方便分拣出你的序列
: 比如有时候可以两个样品一起测
: 但是barcode不一样后期还是可以区分开来
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k*******s
发帖数: 214 | 28
【在 m******i 的大作中提到】
: 哦,原来是这样, 多谢.
: 那测完序的话, 他们会告诉你primer和barcode的序列,
: 然后,你就可以找出那些来自细菌的序列了,
: 但是,可不可能有相同序列来自多个测序片段, 如有, 那该怎么办呢?
: 另外,对测出来的序列,是不是有一定长度要求,比如说,50个碱基以下不考虑.
: 不好意思,问题太多,太蠢, 请多包含.
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k*******s
发帖数: 214 | 29 无论pyrosequencing 还是NGS，得到的数据都是整个基因组的信息，不是你想要的rDNA
序列。很浪费。
一个可行的办法，就是用PCR，直接PCR全长的rDNA,模板是样品直接提取的gDNA (粪便
样品），然后做subcloning，就可以分析。可能要测很多序列，比如几万个。优点是序
列干净，可靠，全长 |
m******i
发帖数: 73 | 30 16s rRNA pyrosequencing 之前不就是要用PCR 放大吗?
所以,需要特定的primer针对16s rRNA的某个区域,
然后得到pcr产物后,再测序, 我的理解对吗? 谢谢.
rDNA
【在 k*******s 的大作中提到】
: 无论pyrosequencing 还是NGS，得到的数据都是整个基因组的信息，不是你想要的rDNA
: 序列。很浪费。
: 一个可行的办法，就是用PCR，直接PCR全长的rDNA,模板是样品直接提取的gDNA (粪便
: 样品），然后做subcloning，就可以分析。可能要测很多序列，比如几万个。优点是序
: 列干净，可靠，全长
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C*******e
发帖数: 4348 | 31 pyrotag sequencing怎么回事整个基因组的信息呢
都是用通用rDNA的primer先做PCR
放大variable region
然后再测的
做metagenomics之前一般也会先做个pyrotag 的trial
看看是不是值得做meta
rDNA
【在 k*******s 的大作中提到】
: 无论pyrosequencing 还是NGS，得到的数据都是整个基因组的信息，不是你想要的rDNA
: 序列。很浪费。
: 一个可行的办法，就是用PCR，直接PCR全长的rDNA,模板是样品直接提取的gDNA (粪便
: 样品），然后做subcloning，就可以分析。可能要测很多序列，比如几万个。优点是序
: 列干净，可靠，全长
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c**********e
发帖数: 70 | 32 请问你所说的做metagenomics之前做一个pyrotag的trial，看看是不是值得做
metagenomics，有什么参考文献吗？
我们最早的是PCR-单克隆-sanger，后来是PCR-454， 目前在考虑是不是做meta，因为
PCR的区域似乎不能提供我们希望的resolution，你所说的评价是否做meta是怎么一回
事啊？
【在 C*******e 的大作中提到】
: pyrotag sequencing怎么回事整个基因组的信息呢
: 都是用通用rDNA的primer先做PCR
: 放大variable region
: 然后再测的
: 做metagenomics之前一般也会先做个pyrotag 的trial
: 看看是不是值得做meta
:
: rDNA
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