P******m
发帖数: 21 | 1 标准品是DNA，melting curve很正常，样品是RNA用random primer 做RT 来的cDNA，
melting curve有个小峰在主峰前面。样品RNA相对单一，没有non-target RNA 干扰。
貌似不是PCR的问题，是不是RT的问题，random primer做RT 造成的背景？qRT—PCR我
是新手，请人指点一下。 |
R****n
发帖数: 708 | 2 小峰温度是多少？貌似primer dimer.提高点hybridization temperature试试 |
P******m
发帖数: 21 | 3 应该不是primer dimer, 因为标准品的曲线没有小峰。
【在 R****n 的大作中提到】
: 小峰温度是多少？貌似primer dimer.提高点hybridization temperature试试
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h********n
发帖数: 4079 | |
C*******e
发帖数: 4348 | 5 对，建议lz跑胶
melting curve是辅助
当你对melting curve有疑问的时候，那个样品还是要跑个胶才好
【在 h********n 的大作中提到】
: 产物跑胶看看.
: 跑胶确认才是王道.
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n**********s
发帖数: 14 | 6 有可能DNA AMOUNT高一些, 如果RNA量相对低的话, 有出PRIMER DIMER的可能...
RUN A GEL +1 |
P******m
发帖数: 21 | 7 问题解决了，确实是RT的问题，降低了random primer的浓度或者用specific primer就
没小峰了。 |
c******e
发帖数: 350 | 8 是不是RT以后没有RNase treatment?
小峰是 RNA-DNA hybrid? |
c******e
发帖数: 350 | 9 是不是RT以后没有RNase treatment?
小峰是 RNA-DNA hybrid? |
c******r
发帖数: 3778 | 10 很多real-time pcr做的是one-step RT-PCR。中间不用RNase treat。实际上比分开两
步做更准确。
但是一般做one-step RT-PCR多用target specific的primer做RT，呵呵，PCR primer多
数可以直接做RT，算好annealing temperature就好了。如果用random primer或者poly
-A做RT，很容易出现这种多peaks的问题。解决办法就是lz发现的办法。
【在 c******e 的大作中提到】
: 是不是RT以后没有RNase treatment?
: 小峰是 RNA-DNA hybrid?
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