a****a
发帖数: 3905 | 1 oligo microarray实际上不是print, 而是在solid surface上合成.
基本的原理是, 先将一个碱基固定上去,(当然, 是按照一定的pattern
固定大量的碱基在很小的一个区域内, 不过一个点只有一个), 然后通过
光化学反应合成oligo. 一次加入一个碱基, 每回光照的时候都通过
一个特定的mask, 所以有些点加入了这一碱基, 有些点没有.这样就
可以在一个chip上合成各种不同的oligo.
一般而言, 会由若干个不同的oligo代表一个gene, 有些是特异的,有些
是非特异的, 这样根据不同的hybirdization intensity就可以得出所
检测的DNA的量.
PCR类的, 从技术上讲要简单的多, 实际上就是把PCR产物通过极细的针尖
点在slide上, (就是一般的slide啦), 然后固化, 后处理. 一般而言, 在
2cm见方的区域内点上5000到6000个点是可行的.
Probe的标记一般是用荧光染料, Cy3-UTP和Cy5-UTP是最常用的. |
|
d*****r
发帖数: 2583 | 2 ☆─────────────────────────────────────☆
xlow (low) 于 (Mon Feb 23 00:52:33 2009) 提到:
如果想lively地trace一些有某个RNA特异表达的细胞，有没有什么比较成熟的方法？
我看到有人利用一段RNA 通过二级结构和一个蛋白的特异结合，然后通过fusion了GFP
的这个蛋白来marK RNA的位置， 但是背景很高，在整个细胞的level上估计根本看不清
楚。。。
不知道各位见过／听说过别的方法啊。。谢了。。。
☆─────────────────────────────────────☆
sunnyday (艳阳天) 于 (Mon Feb 23 01:09:18 2009) 提到:
就是这个方法。在细胞水平上要看到没有问题。
GFP
☆─────────────────────────────────────☆
ahche (啊且) 于 (Mon Feb 23 01:27:43 2009) 提到:
MS2 or lambda-N are still the most po |
|
Y*****o
发帖数: 56 | 3 目前用的是Invitrogen的V5, (cat. R960-25), 对某些蛋白还可用，能看见特异带。
但对有些size的，被非特异条带干扰的厉害 （尤其是60Kd和以下的），没法看。如果
60KD以上有杂带，无所谓。
有没有哪个V5比较clean,特别是60KD以下没有干扰。
多谢！！ |
|
t****p
发帖数: 1504 | 4 如果要成为工具箱的一员，一般来说需要这个小分子具有特异性，特异地作用在某个蛋
白或者pathway上。
作用在已知蛋白的小分子还是可以促进基因功能的研究。比如最初研究的时候是发现这
个基因在癌症发生的作用，那么它对脑神经的作用，对血细胞分化的作用并不一定知道
。现在做实验也常常会用某些蛋白酶抑制剂来确证结果，就证明这些小分子的价值。
如果这个筛选成本不太高的话，我觉得就可以系统地筛一类蛋白的抑制剂或者激活剂。
比如筛所有kinase的抑制剂，不管知不知道功能，然后拿这个特异的抑制剂小分子来研
究这些蛋白酶的在不同组织的，不同发育阶段的功能。
小分子筛选还有一个应用现在正在开展，我不知道归到哪一类。就是取代defined
factors，诱导ips，或者诱导细胞转化，或者细胞之间的转化 trans-differentiation
。我还忘了说一点，小分子作用以后一般可以可逆地去掉。这个比起一直过表达转录因
子有着本质的优势。
实现
靶点的小分子，和你这个library的概念就不是一个东西了；3，就药物开发而言，算是
有些小帮助，但有起到颠覆性的作用吗？还有很多缺点，不过这些都不重要，关 |
|
t********y
发帖数: 6 | 5 当然也在4度下.
看文章多数是抗体+细胞裂解液两样摇过夜,第二天再上珠子,可我这样做拉不下蛋白.
如果三样同摇,条带倒有了,又怕是非特异.卖我抗体的说他们就这么做(摇三样过夜)没
问题,IgG也不会有条带,结果我这么做IgG对照又有条带!(不过我这个IgG质量也有些可
疑)
其他方法也在试,如果加大IP抗体的量吧,似乎珠子就有些凝聚成坨,似乎也加大非特异
的风险.
有没有人有经验指点一下,这么做行么?谢谢了 |
|
k****4
发帖数: 43 | 6 这么说是每个个体对同一抗原都会产生同一种抗体？如果这样是不是只是量会有不同？
比如对某种病菌，某些体质弱的个体易染病。是不是因为产生的抗体少的缘故？还是
产生的抗体不够特异？有没有对某种抗原不产生抗体的情况？也就是说是否存在特异
的免疫突变体？
的排
否最 |
|
t*d
发帖数: 1290 | 7 现在的药都是裸传。以后的药我估计都在外面包个壳，只有到达目的地才释放。最容易
想象的是改造肝病毒，让他携带siRNA，特异释放到肝细胞中。
其它穿纳米马甲（NP）的药，需要多一点的想象力。首先需要病灶附近的micro vessel
的molecular marker，然后在NP上连个sensor，发现这个marker就停下来，弄个口子，
把自己弄出血管。另外，对大多数病灶来说，NP太大，挤不到病变细胞周围去，所以有
人考虑在NP上加一些东东降解一点细胞间质。最后靠病变细胞的 marker 触发药物释放。
如果这些马甲可以做成，候选药就多多了。很多问题都是都不是问题了。救活一个细胞
不容易，杀死一个细胞其实蛮容易的。关键是如何特异地杀死某一种细胞。
对于 toxicity marker，看了点东西，但是还没有一个完整地靠谱的概念，所以说是我
不靠谱地感觉。等以后我找到一点谱以后，咱们再找机会八吧。
被 |
|
E*C
发帖数: 1629 | 8 我们做一个试剂盒.检测酶活性,纯化的酶效果良好.但用血浆切就不行.
非特异切割的太多了.
我的底物片断很短,10个氨基酸的样子.
能不能有什么方法修饰一下,减少非特异切割呢?
多谢 |
|
i*S
发帖数: 175 | 9 我做realtime PCR，每个基因设了三个一组的无模板空白对照，发现有的对照会在循环
末阶段扩增。通过threshold时，大概是在三十多的Ct吧。三个replicates的Ct值十分
接近。
这应该是非特异扩增吧，但是我查看了下熔解曲线，发现峰值也固定，80度，将近同时
测定的模板正常熔解温度了（86）。既然峰值都固定，还可能是“非特异”吗。
想问下这样大概是什么原因？有什么手段可以消除呢？提高退火？可我现在的退火温度
只比最低引物Tm低一度多点。 |
|
K**********e
发帖数: 188 | 10 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
很干净，几乎没有非特异的带。在
我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
奶
他那个抗体是ChIP级的 人家都用来做ChIP了 效果很好。在我手里这个德性 哭死 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 11 咦！你们也有这个经历啊？我三年前用的那个anti-FLAG(M2)很好使。
但是今年中间用了隔壁实验室新订的同样的抗体，就是怎么都没有特异信号，
后来只好悻悻的把三年前在－２０存起来的使用过的回收液拿来用，幸好
还可以。
我怀疑sigma 是不是他们的冷库出了问题？那么多不同的产品都纷纷的在今年
出问题？我们实验室另外一个人用他们的特异性水解酶，以前都很好用的，
最近订的一批突然就不特异了，放什么东西都噼里啪啦的全部切成了小肽，
简直就跟trypsin 差不多！
而且Sigma很讨厌的一点是他们从来都不会认错，打电话给他们抱怨的时候
态度傲慢得一塌糊涂，退款换货是没有的。
NND |
|
w***z
发帖数: 1158 | 12 也碰到过这个问题。
用质粒做模板标记探针，针对同一基因做了2条探针，其中一条探针blot后只有特异条
带，但另一条除了特异条带外，18 28S也都有。总RNA和mRNA都试过，结果相似。 |
|
z********i
发帖数: 610 | 13 用多大浓度的imidazole可以最大限度的减少非特异的结合？
我做了一个negative control：beads only+protein（beads没有用BSA处理），50mM
imidazole，发现很强的非特异的结合。
多谢 |
|
m***o
发帖数: 272 | 14 western blot上在别的组织上有个短的条带在WT上有，但是在knockout上就消失，别的
非特异条带没有变化。但是我现在觉得这个我找到的shortform不是看到的那个条带，
因为根据这个序列推测蛋白要小很多。
现在我比较确定这个shortform mRNA 的表达在我做的这个组织上很高，因为RT用这个
短的5UTR为forward primer（全长没有这个序列），可以看到很亮的条带，但是别的组
织没有。
我现在也有些不知该怎么往下做，因为抗体不是很好，很多非特异条带。 |
|
g*********d
发帖数: 233 | 15 RNA干扰及其在动物繁殖中的应用
2009-12-28
RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通
过 RNA 调控基因表达的机制, 它是指在真核细胞中引入双链 RNA分子从而导致具有序
列同源性的基因产生特异性基因沉默 (gene silencing)的现象 。由于 RNA干扰可以阻
断特定的基因表达, 具有超越疫苗和抗病毒药物的诸多优点, 因此在阐述基因功能以及
蛋白质相互作用等方面, 表现出诱人的前景。近年来随着分子生物学的发展, RNAi 的
机制也不断被阐明, 同时国内外研究也证实 RNAi 技术可以为动物繁殖过程中所涉及的
基因功能提供一条新的思路, 这在科研和生产实践上都具有重要的意义。
1 RNAi的发现
Matzke 等于 1989 年报道了启动子介导的序列同源性基因共转染烟草可引起转
基因表达发生沉默。 1990 年, Napoli 和 Van der Krol 等为了让矮牵牛花的颜色更
加鲜艳, 把与紫色相关的查尔酮(chalcone)基因转染到牵牛花内, 结果意外发现, 植物
体的颜色... 阅读全帖 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 16 6xHis 不是一个好选择，因为非特异结合非常严重（其实也不是真的非特异，
而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子）
你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧？这个应该说
是“表面浓度”。
Antibody 的个头其实不是问题（再怎么大也超不过20nm)，而是cross-linking
efficiency 会是大问题。
如果这个对你们真的很重要的话，可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads |
|
i*****g
发帖数: 11893 | 17 当年我做了很多tandem affinity purification + silver stainining
negative control一样有特异条带组合
negative sample（也就是无目的蛋白的cell lysate） 一样出来特异条带组合
我琢磨了半天，猜测，生物学所谓的这种control，也是很粗糙的,清理不了背景
放大1000倍后，这些control本身也是一个世界
琢磨到这个份上就进了 枝节；还有些想法，，，
现实的玩法就是
negative control，
statistical analysis
making story
sell it to the CNS editor, reviewers,
profiting and move |
|
j****x
发帖数: 1704 | 18 非特异扩增可有时可以通过提高退火温度来消除，或者使用probe来提高qPCR的特异性
，另外，你可能还需要片段化一下你的模板genimic DNA，
如果你的非特异条带的溶解曲线和实际产物差别较大的话，在有些机器上可以直接排除
在读取范围之外从而消除对定量的影响 |
|
s*********t
发帖数: 600 | 19 H3K9Me2和H3K9Ac不是组蛋白，只是组蛋白H3尾巴上的某个氨基酸的修饰。针对这些修
饰有特异的抗体（当然有的不像自己声称的那么特异）
选K27me3/2 K9me3/2/1 K4me3/2 K9ac看看，再用针对H3的抗体做control，normalize
在TSS前边选几段 做Q PCR
还可以看H2Bub，pol II的磷酸化吧，根据你的实验和对细胞的处理 |
|
I*******o
发帖数: 49 | 20 【 以下文字转载自 Postdoc 讨论区 】
发信人: ItoMakoto (ItoMakoto), 信区: Postdoc
标 题: 如何研究转录因子的功能？
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Mar 22 23:32:01 2012, 美东)
我现在有一个影响干细胞的转录因子，表达也很特异，请问如何找该基因的下游或者他
的调节子呢？
我想到几点,请大家补充!
1: 比较野生型，突变体和超表达的材料的芯片表达谱，可以找出一些下游基因；
2：用诱导系统如GR做芯片，也可以找出一些下游基因；
3：用上面的材料做CHIP-seq
4：已知我研究的这个转录因子A与其他转录因子B互作转录下游基因，然后我比较A和B
的芯片表达谱，找共同的基因；
5：分析CHIP的结果，找出下游基因的motif，然后在全基因组搜索？
6：将前面的实验全部再弄一遍cell specific microarray？
请各位补充，特别是实验设计上，有没有巧妙的设计，我这个维持干细胞的转录因子表
达很特异，也发现了它的一些调控子，该如何继续做呢？ |
|
b*****n
发帖数: 1841 | 21 搭车问几个问题：
有没有在几天大的小鼠打tamoxifen的？
有没有特异表达毒蛋白杀特异细胞的成功经验？
CreER表达很低（正常诱导<10%）有没有成功提高到50%以上的？ |
|
s******y
发帖数: 28562 | 22 一般来说，摄入饮食营养过渡之后会在细胞里产生活性氧，这个是导致心脏和
其他细胞损伤的重要机理。而活性氧本身和发炎什么什么的也有关。
所以最可能的情况，就是你这个因子是身体其他地方在营养过剩的时候释放出来的
一个类似发炎因子的东西，在平时，既有促进代谢的功能，也有导致细胞损伤的副作用
（大肆进行代谢会导致活性氧分子过多而损伤细胞）。
你现在把这个因子去除了，代谢就变慢了（所以胖了，而且吃得也少了），
同时心脏（以及其他细胞）因为不再收到这个信号，所以也就不会受损伤了。
因为你这个因子是一个小肽所以一旦分泌出来就全身都会有，所以你没有任何
必要对它做器官特异的KO（没有用的）。 如果你真的要做的话，不如先找
到它在细胞上的受体，然后再在器官里（比方说心脏）特异的去除那个受体，
才是比较正确的做法。
你可以针对这个假说来做进一步的机理确认。再多的我就不说了，再说下去我可要
要求在你们的文章里署名了。哈哈哈（我开个玩笑）。 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 23 利用人工智能免疫系 likes CD44 plus Hyaluronan (hyaluronic acid, HA) is a
linear naturally occurring polysaccharide 钓3kDa左右的多肽的鱼
可以不通过分离而直接挑出peptide or protein来特异反应--just matrix two cents.
References:
1)
Erickson M, Stern R.
Chain gangs: new aspects of hyaluronan metabolism.
Biochem Res Int.2012:893947.
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22216413
and
2)
Chaim OM et al.(2011)
Brown Spider (Loxosceles genus) Venom Toxins: Tools for Biological Purposes.
Toxins (Basel). 3: 309-344
Abstract
Venomous animals use ... 阅读全帖 |
|
s******a
发帖数: 472 | 24 一言难尽啊
实验室有另外一个高年级PHD，做和我类似的课题。
刚进实验室是他带我。他坚持认为越长越特异。所以我设计探针都按他建议的长度设计。
由于结果一直是smear，我就和他探讨是不是probe太长，非特异结合的可能性也大。
他直接否定我的想法，还是认为越长越好。
题外话，他基本从来没有肯定过我的想法。。。 |
|
e****s
发帖数: 1125 | 25 我说的确实是药物的特异结合位点。有binding和特异抑制的数据。
谢谢，很有帮助！ |
|
s*****g
发帖数: 87 | 26 不太可能，CRISPR的特异识别序列只有14bp，很容易target到其他genomic region
TALEN的特异识别序列有30-60bp,远远高于CRISPR |
|
i*********0
发帖数: 915 | 27 你的probe是从载体里面切的么？
我以前做Southern也遇到这样的问题。我的probe也能在marker上产生signal，但是在
我的样品上是特异的带。
我估计是切下来的探针也带了一点plasimd的序列，和marker有cross reaction。
不过你在样品上看到smear带，可能是washing的不彻底，或者探针不特异。 |
|
i****g
发帖数: 3896 | 28 北大邓宏魁和汤超发的：
邓宏魁与汤超研究组在《细胞》（Cell）发表封面论文报道细胞重编程过程中的创新方
法和理论
日期： 2013-05-27 信息来源： 生命科学联合中心
北京大学生命科学院邓宏魁研究组和北京大学定量生物学中心汤超研究组合作，首次证
明小鼠体细胞重编程可由调控分化的基因完成，并在此基础上提出细胞命运转变的“跷
跷板模型”。2013年5月23日，该成果研究论文“Induction of pluripotency in
mouse somatic cells with lineage specifiers”于《细胞》（Cell）期刊以封面文
章形式在线发表。《细胞》同期还配发了希伯来大学Nissim Benvenisty教授对于该工
作的评论文章。
“Seesaw模型”的landscape图
细胞命运决定的“跷跷板模型”
2006年，日本科学家Shinya Yamanaka发现向小鼠体细胞转入胚胎干细胞特异因子（
OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC）可以完成体细胞的重编程。在此之后，细胞重编程领域普
遍认为向目标细胞状态的转变需要靠在目标状态中特异高表达的... 阅读全帖 |
|
i****g
发帖数: 3896 | 29 邓宏魁今年爆发了，又一篇Science：
《科学》（Science） 杂志发表北京大学邓宏魁团队的重大研究成果——使用小分子化
合物逆转“发育时钟”
日期： 2013-07-18 信息来源： 生命科学学院
7月18日，国际学术权威杂志Science杂志（Science Express）刊登了北京大学生命科
学学院邓宏魁教授和赵扬博士带领的研究团队在生命科学领域的一项革命性的研究成果
——用小分子化合物诱导体细胞重编程为多潜能干细胞。该成果开辟了一条全新的实现
体细胞重编程的途径，给未来应用再生医学治疗重大疾病带来了新的可能。
在这项研究中，邓宏魁团队仅使用四个小分子化合物的组合对体细胞进行处理就可以成
功地逆转其“发育时钟”，实现体细胞的“重编程”。使用这项技术，他们成功地将已
经特化的小鼠成体细胞诱导成为了可以重新分化发育为各种组织器官类型的“多潜能性
”细胞，并将其命名为“化学诱导的多潜能干细胞（CiPS细胞）”。
哺乳动物细胞只有在胚胎的早期发育阶段具有分化为各种类型组织和器官的“多潜能性
”，而随着生长发育成为成体细胞之后会逐渐丧失这一特性。人类一直在寻找方法让已
分化的成体... 阅读全帖 |
|
m******5
发帖数: 1383 | 30 其实我觉得非特异带才是最靠谱的
大多数时候上样量差一点beta actin也是平的，反而非特异带如实反映了趋势差别 |
|
k*****n
发帖数: 417 | 31 颜宁自己的评论：
http://blog.sciencenet.cn/blog-281238-801436.html
[30]颜宁 2014-6-8 11:10
多谢曾老师科普。我自己本来计划着写一篇博客，讲讲Warburg Effect，导致GLUT1在
许多癌细胞里面超量表达，以及据此目前的一些GLUT1 inhibitor在抑制特异种类的
tumor （RCC）里面的一些进展。不过，这基本成个小综述了，要加很多文献；而我本
人自从不做细胞凋亡之后就没再研究癌症，怕出差错，所以慢工出细活。于是就偷懒在
微博上写了几句先：
“我再重申一遍，从基础科研到制药，路漫漫其修远。而我在讲述GLUT1的时候强调的
是基础研究本身的意义，那么为何会冒出”饿死癌细胞“这种极具噱头的新闻呢？因为
我在回答问题的时候说：细胞需要ATP维持生命活动；正常细胞除了葡萄糖，还可以通
过氨基酸、脂肪酸等能量物质；而大脑也可以勉为其难地用酮体 ；但是实体瘤因为缺
氧，其ATP只得依赖于糖酵解产生的ATP，所以对葡萄糖格外依赖。这也许提供了一个思
路，是否可以通过抑制葡萄糖摄取而定点抑制肿瘤细胞生长？可是癌症如... 阅读全帖 |
|
p*******i
发帖数: 449 | 32 最近在用CRISPR来删除一部分基因组，就在试验细胞系上成功地看到一次正确的删除。
其他目的细胞系尝试全部都是未删除。具体就不说了，只说一个问题：
我使用下列两个CRISPR来做double strand break. 两个CUT之间不想引入任何序列。然
后通过系列稀释和PCR筛选正确的删除细胞克隆。
CRISPR1 gRNA特异部分: XXXXXXXXXXXXXXXXXGT()TAA
CRISPR2 gRNA特异部分: XXXXXXXXXXXXXXXXXAG()TAA
具体序列保密，不方便透露。 两CRISPR相距400bp. 括弧是double strand break位点。
我发现重组修复后，如果精确剪切和连接，会产生一个完全相同的CRISPR位点。 如果
我做的是瞬转， 这个位点会不会再次被“CRISPR1"识别和剪切？ 如果如此，是不是大
大降低了我得到正确克隆的可能性？是不是可以解释为什么我重复4 5次，筛几百克隆
无一正确的原因？
请大家讨论指教，非常非常感谢！ |
|
m*******u
发帖数: 30 | 33 拙作《道德经新论》（副标题：揭开宇宙和生命的玄秘），全书计分九篇，共300万字
，历经20年，已于日前完成。兹发布于网络，供有兴趣者参研、指正。
下载链接：
1，百度云盘：pan.baidu.com/s/1kT9kXAR
2，天翼云盘：cloud.189.cn/t/b6rumejUfIni
3，360云盘：yunpan.cn/csdM5RZcTEHuf （提取码：99a8）
三个网盘文件一致。下载后请对比
MD5值：7415C8E37A6D817477F27D8E562C5FEF
SHA1值：
D7C79ED4B837B07DC24158E889DE3A9F4B614763
压缩包中提供了三种文档格式。第一是WORD版，第二是HTML版，第三是PDF版。阅读时
根据个人喜好。压缩包中另有检索软件等。
著者声明：
1，著者并无出版之想，请勿为此费心。
2，任何个人和团体，在非商业、非获利前提下，可以任意复制、交流、引用，且
无须征得著者同意。
3，欢... 阅读全帖 |
|
z****u
发帖数: 1007 | 34 几年前基于inducible Cre的lineage tracing技术的出现对stem cell的研究是关键的
。但并没有很多stem cell 的 in vivo marker被identified出来。比如说liver
tissue,都知道其可以再生，但是它有没有stem cell仍然在争议。更莫提marker了。
endothelium是个快速turn
over的组织，但起在成体内stem cell population的identification仍然未知。
筛选stem cell marker的方式可以有两个途径
第一就是正向的从已知marker出发，比如说通过已知marker筛选出某stem cell
population, 分析其有啥gene 高表达，以此出发建立CreERT transgenic model来确认
新的marker.
对stem cell来说找到marker不是目的，更重要的是这个maker背后的mechanism. 一个
新的marker市时常可以揭示新的regulation mechanism.
第二个途径是逆向寻找，说来就有些盲目了。就是我说的直... 阅读全帖 |
|
s*****i
发帖数: 315 | 35 pTyr的抗体必须用bsa block 和 bsa做1抗buffer, 二抗可以用milk
其他的，特别是特异蛋白特异位点的抗体，可以用milk，milk的背景低
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7 |
|
l***i
发帖数: 36 | 36 毕竟B不是抗体，在不知道A，B相互作用强弱的情况下用flow很难检测到，相对于flow
，IP后用WB检查具有更高的sensitivity，并且很多非特异作用的蛋白，可以通过分子
量大小与目标蛋白区别开，而这些非特异的background，在flow染色和检测中仍然存在
。我建议你可以考虑尝试类似于ELISA的检测方法。 |
|
s******s
发帖数: 795 | 37 想研究protein A与B/C/D等的相互作用。
因为没法（或者很难）把蛋白A偶联到sepharose beads上，但是有commercially
available biotinylated protein A可以直接买（sepharose conjugated with
streptavidin当然也有卖），所以计划通过streptavidin+biotin搭桥，间接把protein
A
结合到sepharose beads上（sepharose-streptavidin + biotin-protein A），然后装
填柱子，然后apply protein B/C/D。
从来没做过avidin+biotin相关的实验，请问有朋友做过类似的么？streptavidin+
biotin的结合够强壮么？
假设 protein C可以与protein A结合，最后形成sepharose-streptavidin + biotin-
protein A + protein C。在wash和elute的时候，有特定的或者通用的条件可以
1。wash掉非特异结合的其他protein
2。特... 阅读全帖 |
|
M*******C
发帖数: 183 | 38 不知道在大家手上work的怎么样？买过好几种抗体。
在我手里，trouble很多啊，要么一堆杂带，没有特异带；要么背景很脏很黑，也看不
到特异带；要么带是白色的，并且结果也不是想要的。而类似的问题，我handle其他公
司的，失败率没这么高。测同一个蛋白，abcam的很好用，clean，结果正确。cell sig
的乱七八糟。trouble呢，公司都宣称在他们手里好用。
他们的western protocol是这样的，很不一般，大家觉得合理吗
Block： 5% Milk TBST （他们说不能用BSA)
一抗： 5% BSA TBST 稀释
二抗： 5% Milk TBST
平时我们要么是block/一抗都BSA. 要么是牛奶block， 一抗直接在TBST. 二抗从来只
是TBST. work的抗体总是work了。
而cell sig 的， 有的抗体，即使完全按照他们的说法，甚至他们寄来 positive ctrl
， 也不work， 而他们的positive ctrl， 我用 abcam的抗体轻易检测出。 abcam 的
问题是现在卖的太贵。而cell sig的花了钱不w... 阅读全帖 |
|
c********b
发帖数: 363 | 39 我做的植物细胞，在植物里面一般都是说取多少gram的叶子或者苗做起始材料，到了核
这一步不像你们那样再计数的，所以我也不知道该怎么回答。我一般放NEB的MNase，5-
10g的起始材料，拿到核以后放5000-10000 gel units。
我做RNA-IP是拿特异抗体处理，非特异抗体做negative control。如果是一般的WB，
histone和ADK kinase分别做marker。如果是RNA，就是U2或者U6。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 40 我以前试验过好几种方法，包括我说的那个RNA ligation 的高大上方法，后来发现最
简单最有效的方法就是经典方法：
第一步. 用OligoDT做primer来合成cDNA
我推荐 SuperScript First-Strand Synthesis System
第二步.用基因特异的primer来克隆感兴趣的基因，注意引物要离基因的编码区的
开头(ATG)和结尾(Stop codon)至少有20bp距离（下面我会说原因）。如果基因
的GC含量高，可以用Herculase来做PCR, 不然的话我一般都直接用heat-activated Pfu
turbo.这样非特异带少。
第三步。如果上一步克隆得到的带太多，或者得到一个smear, 那么就再把得到的
产物简单过小柱子纯化后直接用nested primer重新再扩增一次，这样一般都可以
得到一个非常纯的条带。
Nested primer设计的时候必须在上一步用的引物的内侧（这个就是为什么第2步的引物
我告诉你说离开头和结尾有至少20bp距离,就是为了给Nested primer预留地方的）。
primer? |
|
g*****n
发帖数: 250 | 41 对于Figure 4, 大家都在等测序的结果，我就没细看。看到对4a的讨论，我就细看看。
对4a质疑是有道理的。G5和G13相差几十个nt，胶上应该看得出差别。
另外，按Figure 3，如果NgAgo随机切，在一个guided 24nt区域里应该可以切到相差十
几个nt的产物。在PAGE在样高分辨的胶上是应该看得到。即使不会是清晰的带，多带倾
向现象应该看得出来。可是，作者所有测试的基因都是两条产物带。
Figure 4d, 两个黑箭头指给读者看两条产物带。可是，在这两条带之间还有一条带（
300左右）。这条带和250下边的产物带一样厚，作者确不理了。这条带很难用污染或非
特异来解释，因为，那些PCR产物都是纯化后才做T7E1的，而且每个样品都有。
有些不解的是，Supplementary Figure 10显示，作者用一对引物可得到两条清晰的带
。很好的引物。可是，在正文的实验里，作者却用了另外一对引物，而得到一条模糊的
带和“非特异”带。 |
|
c********n
发帖数: 225 | 42 【记录历史】谁重复验证了NgAgo？
引子
我们生活在一个幸运的时代，我们生活在一个变化的时代。
历史就在我们每一天不经意的时候悄悄地留了下来。
世界各地的2016年都不同寻常，记录一下有些瞬间即逝的印记。
Ago 和CRISPR/Cas 是两个世代相传的家族，各自有各自的功能，各自在各自
的地盘上行使着自己的职责。
CRISPR/Cas率先冲出功能区禁锢，领跑出了基因组编辑的新天地。
Ago家族呢？有没有也隐藏着可以编辑基因组的黑马？
2014年2月，荷兰John van der Oost组在Nature杂志上发表了关于Ago家族
成员TtAgo的研究，为Ago功能区域拓展，照进了一线光亮。
2016年5月，中国的韩春雨组在Nature Biotechnology 杂志上，发表了关于
这个家族成员NgAgo的科研论文，用实验数据论证，NgAgo就是Ago家族基因组
编辑的一匹黑马，而且是一匹可以与CRISPR/Cas9 齐头并进的黑马。
俗话说，是骡子是马，拉出来溜溜才能分得清。
任何此类“发现”，特别是带有工具性质的技术，一旦以科研论文形式发表，
就会被世界各地的业界同仁们重复实验... 阅读全帖 |
|
c********n
发帖数: 225 | 43 【记录历史】谁重复验证了NgAgo？
引子
我们生活在一个幸运的时代，我们生活在一个变化的时代。
历史就在我们每一天不经意的时候悄悄地留了下来。
世界各地的2016年都不同寻常，记录一下有些瞬间即逝的印记。
Ago 和CRISPR/Cas 是两个世代相传的家族，各自有各自的功能，各自在各自
的地盘上行使着自己的职责。
CRISPR/Cas率先冲出功能区禁锢，领跑出了基因组编辑的新天地。
Ago家族呢？有没有也隐藏着可以编辑基因组的黑马？
2014年2月，荷兰John van der Oost组在Nature杂志上发表了关于Ago家族
成员TtAgo的研究，为Ago功能区域拓展，照进了一线光亮。
2016年5月，中国的韩春雨组在Nature Biotechnology 杂志上，发表了关于
这个家族成员NgAgo的科研论文，用实验数据论证，NgAgo就是Ago家族基因组
编辑的一匹黑马，而且是一匹可以与CRISPR/Cas9 齐头并进的黑马。
俗话说，是骡子是马，拉出来溜溜才能分得清。
任何此类“发现”，特别是带有工具性质的技术，一旦以科研论文形式发表，
就会被世界各地的业界同仁们重复实验... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 44 1 北京大学生命科学学院魏文胜课题组
我们使用了文章中报道的高效ssDNA，同时自己设计了其他2条针对体内其他基因位点的
ssDNA，与NgAgo表达质粒共转HEK293T细胞与HeLa细胞，2天及5天后，用T7E1检测切割
效率，这三条针对2个不同基因的ssDNA，在HEK293T和HeLa两个细胞系中，无论转染一
次还是在8到12小时后再转染一次ssDNA，都没有检测到切割。
针对敲除后能使细胞有表型变化的某特定基因，我们设计了ssDNA，与NgAgo表达质粒共
转HeLa细胞5天后，发现细胞表现出了一定的对应表型，但是把这部分细胞收集起来提
取基因组，对靶位点测序，没有发现基因组序列的任何改变。
我们针对某特定基因设计了6种ssDNA，用特异的荧光报告系统检测是否有靶点DSB产生
，结果显示所有实验组均没有检测到对靶位点DNA序列的切割活性。
2 中科院动物研究所王皓毅课题组
我们在293T细胞中表达带有Flag标签的NgAgo ，在不同时间点检测NgAgo蛋白表达。发
现转染6小时后开始检测到目的蛋白，随着时间的延长蛋白量增加。在人类293T细胞系
中重复原文章中Figure ... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 45 首先，韩春雨目前暂时还没有拿CR的那篇文章为自己作证，贴吧里的内容很难证实。
不过确实有一些人拿这篇文章为韩春雨洗地，比如科学网里那几位高呼韩“春雨亮剑了
！”“NgAgo确实能识别和结合特异DNA序列，下一步就是编辑了！”
老实说，我对这篇文章非常不满，它最后的结论居然是NgAgo提供了另一种在斑马鱼体
内进行knockdown的策略！作者还跑出来说他们的研究既不支持也不反驳韩春雨的结论。
荒谬！！！
这篇文章如果是质疑韩春雨的NgAgo，那么它的聚焦点应该是NgAgo的基因编辑功能，而
不是knockdown，NgAgo的knockdown只是附属结果，而且是一个没啥大的科学意义的结
果。最后的结论应该是，NgAgo不具备基因编辑的能力。只有这样，在当下，它才有发
表的价值
如果这篇文章是为了找到一种knockdown的蛋白，那有个屁的意义，基因沉默的手段多
了去了，这文章最多发个省级期刊，知网收录的那种。
总而言之，一篇既不支持也不反驳NgAgo基因编辑的研究，发了有个毛的意义？反而搅
混水，误导大众！
此外：
13太保里面早就有人说了！他们通过荧光标记发现NgAgo根本就没有在... 阅读全帖 |
|
o*******a
发帖数: 242 | 46 http://www.bjmu.edu.cn/xxdt/192878.htm
【编者按】中国共产党员、全国劳动模范、首都十大健康卫士，中国病毒性肝炎防治事
业的先驱，中国病毒性肝炎免疫学检验的奠基人，北京大学肝病研究所（原北京医学院
肝病研究所）的创始人，中国第一支血源性乙肝疫苗的研制者，北京大学肝病研究所首
任所长、名誉所长陶其敏教授于2017年11月15日15点27分因病在北京逝世，享年86岁。
她是打响中国乙肝阻击战的第一人，她在自己身上试验了中国第一支乙肝疫苗，她为中
国检验医学事业、特别是肝病的实验诊断作了突出的贡献。谨以此文，深切缅怀陶其敏
教授。
一辈子只做一件事
早在70年代，陶其敏开启了我国预防乙肝的先河。
1975年7月1日，我国第一代血源性“乙肝疫苗”研制成功。但当时的中国不具备疫苗敏
感性和安全性试验的条件。为了“疫苗”早日应用于人体，陶其敏毅然伸出手臂，接种
了第一支乙肝疫苗进行试验。
1975年8月29日下午，陶其敏教授第一个注射了自己研发的中国第一支乙肝疫苗
随后，她带领团队书写了多项中国肝病研究的第一，在病毒性肝炎研究领域作出了卓越
的贡献：
明确首例中... 阅读全帖 |
|
m*********5
发帖数: 552 | 47 某天跟我上司讨论，说中国文化很厉害，就是很难讲清楚。尤其是用“科学”的方法。
其实依我的浅见，你说的那些“特异的物质”，中医里就是“外邪”。并不一定要浪费
时间找出那是什么东西，而且你也说了，要找出来，还是不太现实的。而你后来说“但
是通过一定的养身调理人体的免疫系统，排毒排寒系统”，就是建立人体自身的“正气
”。
内经说，正气存内，邪不可干。
套用邢捕头一句话，有时候治病，就是这么简单。
只是没法拿人来做罢了
这就是难点
如果坚持认为对花生过敏是超敏反应，那问这个人对其他什么不过敏
找到花生中特异的物质，短肽，代谢物，多糖，脂类，任何一种
挨个实验
不过这个太残忍，不能拿人来做，所以太难了
但是通过一定的养身调理人体的免疫系统，排毒排寒系统，我觉得会对过敏有帮助的
这个就是可以中西医相互结合的地方了 |
|
c****n
发帖数: 21367 | 48 复杂系统理论告诉我们，存在“哪些分子起作用并特异的抑制那个分子”不假，
“哪些分子起作用并特异的抑制那个分子从而宏观上人体恢复健康”就不行了。
通常情况是，A能抑制B，不幸的是把从C到Z也搞得死去活来（通过某些也许
很长时间的极难察觉的反馈回路，比如最近10年为副作用而召回的那些“特效药”）
更广泛的情况是，好不容易发现了一个牛逼的A，能干掉B，且对C-Z看起来还成，
可惜就是要找到B，需要C-Z的配合，但C-Z都不鸟A（否则就被它干掉了）
只好等待发明纳米机器人。:)
中医的研究方法是系统理论的降维建模，要发展一方面是更准确的拟合，
另一方面是升维。这些都是标准的科学方法。元朝清朝的愚昧以及之后140年
的战乱使得我们自己流失了太多的东西。看看张仲景的医书，很难相信那是
一个将近2000年前的人的成就。他写的东西，按现代科学的标准来看，也是
经典的人体系统实验分析和总结（这还是散失以后的！）。现代西医的投入，
研究人数都远远超过中医，中医相对而言，当然会显得不规范，非主流。
但是我看好中医的方法论，假以时日，投入更多的人力物力，所得到的
收获绝非西医同等投入所能比拟。（想想看这些年药 |
|
n*********n
发帖数: 1534 | 49 哦，这个你话也说绝对了
譬如血友病，我不记得是哪个型了，用基因治疗就可以
但是你要用中医基本就不行
尽管基因治疗这个手段也不是尽善尽美，但是至少在这点上，要比中医强太多了
还是我比较孤陋寡闻，没听说过中医能够医治或者改善血友病病人症状的？
复杂系统理论告诉我们，存在“哪些分子起作用并特异的抑制那个分子”不假，
“哪些分子起作用并特异的抑制那个分子从而宏观上人体恢复健康”就不行了。
通常情况是，A能抑制B，不幸的是把从C到Z也搞得死去活来（通过某些也许
很长时间的极难察觉的反馈回路，比如最近10年为副作用而召回的那些“特效药”）
更广泛的情况是，好不容易发现了一个牛逼的A，能干掉B，且对C-Z看起来还成，
可惜就是要找到B，需要C-Z的配合，但C-Z都不鸟A（否则就被它干掉了）
只好等待发明纳米机器人。:)
中医的研究方法是系统理论的降维建模，要发展一方面是更准确的拟合，
另一方面是升维。这些都是标准的科学方法。元朝清朝的愚昧以及之后140年
的战乱使得我们自己流失了太多的东西。看看张仲景的医书，很难相信那是
一个将近2000年前的人的成就。他写的东西，按现代科学的标准来看，也是
经典 |
|
o******e
发帖数: 1761 | 50 2. 真的明确了西药的药理、毒理、不良反应、有效性么？
如果上面的一切＂科学＂步骤都能解决药理、毒理、不良反应、有效性，那么庆大霉素
就不应该被召回和弃用．
cocoon:
复杂系统理论告诉我们，存在“哪些分子起作用并特异的抑制那个分子”不假，“哪些
分子起作用并特异的抑制那个分子从而宏观上人体恢复健康”就不行了。通常情况是，
A能抑制B，不幸的是把从C到Z也搞得死去活来（通过某些也许很长时间的极难察觉的反
馈回路，比如最近10年为副作用而召回的那些“特效药”）更广泛的情况是，好不容易
发现了一个牛逼的A，能干掉B，且对C-Z看起来还成，可惜就是要找到B，需要C-Z的配
合，但C-Z都不鸟A（否则就被它干掉了）只好等待发明纳米机器人。
这也是为什么一个西药往往用了才3，40年就有抗药性了而完蛋了，而中药用了至少
1000年现在的人病了还照样用。 就拿阿莫西林来说，才用了几年又得往里头加克拉霉
素（它是用来抑制一种酶，这种酶能分解阿莫西林成无活性，而这种酶是有抗药性细菌
产生出来的，也是它产生抗药性的原因）。 这样和微生物赛跑，完全没有赢的可能。
只有累死一途。 要知道，西药尤其是抗生素 |
|
