w******e
发帖数: 1187 | 1 请教：用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
sized peptide/protein自动被immobilize到beads上，并达到尽量高的copy number。
最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence，beads上coat FLAG/HA
antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
请教有什么alternative method？比如his6-peptide的coverage会不会更高？
比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
合用？
非常感谢！ |
w******e
发帖数: 1187 | 2 ding~
【在 w******e 的大作中提到】
: 请教：用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
: sized peptide/protein自动被immobilize到beads上，并达到尽量高的copy number。
: 最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence，beads上coat FLAG/HA
: antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
: 请教有什么alternative method？比如his6-peptide的coverage会不会更高？
: 比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
: 合用？
: 非常感谢！
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s******y
发帖数: 28562 | 3 6xHis 不是一个好选择，因为非特异结合非常严重（其实也不是真的非特异，
而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子）
你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧？这个应该说
是“表面浓度”。
Antibody 的个头其实不是问题（再怎么大也超不过20nm)，而是cross-linking
efficiency 会是大问题。
如果这个对你们真的很重要的话，可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads
【在 w******e 的大作中提到】
: 请教：用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
: sized peptide/protein自动被immobilize到beads上，并达到尽量高的copy number。
: 最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence，beads上coat FLAG/HA
: antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
: 请教有什么alternative method？比如his6-peptide的coverage会不会更高？
: 比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
: 合用？
: 非常感谢！
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w******e
发帖数: 1187 | 4 多谢建议！
是这个。说copy number是每个beads上要coat不同的peptide。btw有什么好方法
测peptide浓度吗？如果已知peptide的部分序列的话
这个倒不知——ab biotinylation应该有满成熟的protocol吧？问题是我希望
每个beads（1到几um直径）上coat至少1e4 peptide,最好1e5以上。。。
要做一个peptide library的话，有点担心用GST做constant tag会不会太大？
有没有可能modification-by-synthesis的方法，加入一个biotin-AA analog，只在
某个位置incorporate的？继续伤脑筋ing
【在 s******y 的大作中提到】
: 6xHis 不是一个好选择，因为非特异结合非常严重（其实也不是真的非特异，
: 而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子）
: 你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧？这个应该说
: 是“表面浓度”。
: Antibody 的个头其实不是问题（再怎么大也超不过20nm)，而是cross-linking
: efficiency 会是大问题。
: 如果这个对你们真的很重要的话，可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads
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s******y
发帖数: 28562 | 5
如果你们有相对应的抗体的话可以简单的用免疫荧光法来测定
的确会有些大，而且会影响你的peptide comformation
有某些特定的氨基酸可以，比方说lysine （侧链被biotinlylated) 我忘记是
哪个公司有生产的了。你可以去骨狗一下。
不过，事先得警告一下，这个肯定会影响你的peptide构型。除非你故意把lysine
放在所有peptide 最后一位。
【在 w******e 的大作中提到】
: 多谢建议！
:
: 是这个。说copy number是每个beads上要coat不同的peptide。btw有什么好方法
: 测peptide浓度吗？如果已知peptide的部分序列的话
: 这个倒不知——ab biotinylation应该有满成熟的protocol吧？问题是我希望
: 每个beads（1到几um直径）上coat至少1e4 peptide,最好1e5以上。。。
: 要做一个peptide library的话，有点担心用GST做constant tag会不会太大？
: 有没有可能modification-by-synthesis的方法，加入一个biotin-AA analog，只在
: 某个位置incorporate的？继续伤脑筋ing
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w******e
发帖数: 1187 | 6 多谢！！
【在 s******y 的大作中提到】
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: 如果你们有相对应的抗体的话可以简单的用免疫荧光法来测定
: 的确会有些大，而且会影响你的peptide comformation
: 有某些特定的氨基酸可以，比方说lysine （侧链被biotinlylated) 我忘记是
: 哪个公司有生产的了。你可以去骨狗一下。
: 不过，事先得警告一下，这个肯定会影响你的peptide构型。除非你故意把lysine
: 放在所有peptide 最后一位。
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o*****r
发帖数: 156 | 7 Biotinylation is too complicated to do in your case, which modifies primary
amine group (N-term and side
chain of lysine).
His-tag will be a good idea.
【在 w******e 的大作中提到】
: 请教：用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
: sized peptide/protein自动被immobilize到beads上，并达到尽量高的copy number。
: 最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence，beads上coat FLAG/HA
: antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
: 请教有什么alternative method？比如his6-peptide的coverage会不会更高？
: 比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
: 合用？
: 非常感谢！
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o*****r
发帖数: 156 | 8 For the his-tagged protein, if you add imidazole in your sample (usually 10-
50 mM) when binding to the Ni
beads, almost no non-specifical binding will be observed.
And his-tag is usually better than GST-tag: 1. it's small; 2. it can be used
for denatured protein.
【在 s******y 的大作中提到】
: 6xHis 不是一个好选择，因为非特异结合非常严重（其实也不是真的非特异，
: 而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子）
: 你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧？这个应该说
: 是“表面浓度”。
: Antibody 的个头其实不是问题（再怎么大也超不过20nm)，而是cross-linking
: efficiency 会是大问题。
: 如果这个对你们真的很重要的话，可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads
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w******e
发帖数: 1187 | 9 Thanks! have you tried strept II tag BTW? bumped into it when googling
10-
used
【在 o*****r 的大作中提到】
: For the his-tagged protein, if you add imidazole in your sample (usually 10-
: 50 mM) when binding to the Ni
: beads, almost no non-specifical binding will be observed.
: And his-tag is usually better than GST-tag: 1. it's small; 2. it can be used
: for denatured protein.
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o*****r
发帖数: 156 | 10 Strep II tag is similar to his-tag, both are very small and specific.
I have not used it before, but I think it's a good system.
【在 w******e 的大作中提到】
: Thanks! have you tried strept II tag BTW? bumped into it when googling
:
: 10-
: used
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