h****k
发帖数: 182 | 1 在cell line上表达A receptor, 用B蛋白IP, A 能被pull down. 但是用B蛋白染色这个
表达A receptor的 cell line却染不上，有人遇到过这种情况吗？如何解释？ |
T*****e
发帖数: 247 | 2 建议楼主把"但是用B蛋白染色这个表达A receptor的 cell line却染不上"和"flow
cytometry"解释清楚一些，我反正没看懂这是什么意思 |
h****k
发帖数: 182 | 3 不好意思，没写清楚。这个实验我用B蛋白和表达A receptor的cell line一起incubate
, 然后加识别B蛋白的二抗（带荧光），最后在流式细胞仪（flow cytometry)上跑。表
达A receptor的cell line没有被B蛋白stain.
【在 T*****e 的大作中提到】
: 建议楼主把"但是用B蛋白染色这个表达A receptor的 cell line却染不上"和"flow
: cytometry"解释清楚一些，我反正没看懂这是什么意思
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w*********3
发帖数: 217 | 4 Surface staining? What if it is intracellular?
incubate
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.2
【在 h****k 的大作中提到】
: 不好意思，没写清楚。这个实验我用B蛋白和表达A receptor的cell line一起incubate
: , 然后加识别B蛋白的二抗（带荧光），最后在流式细胞仪（flow cytometry)上跑。表
: 达A receptor的cell line没有被B蛋白stain.
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h****k
发帖数: 182 | 5 是的，因为是receptor所以就只做了surface staining，我没有试过intracellular
stain, 可以试一下，不过fix这一步可能会提高non-specific staining
【在 w*********3 的大作中提到】
: Surface staining? What if it is intracellular?
:
: incubate
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.2
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T*****e
发帖数: 247 | 6 我总结一下楼主的实验，看看我有没有理解：
1. 在某细胞系中有B蛋白，楼主在其中表达一个A receptor，并假定AB有直接的蛋白相
互作用（连接）。于是楼主做co-IP，用识别B蛋白的抗体拉复合物，在该复合物中可以
检测到A蛋白（抗体识别，我自己脑补的）。
2. 楼主想进一步验证该结合，或者其他目的（筛选，测序等等）。于是在上述细胞系
中（有B蛋白，部分细胞可能转染了A receptor），对该细胞系进行染色（我不知道什
么是surface staining），楼主默认B蛋白在细胞膜上（我脑补的），所以该染色可以
标记所有带B蛋白的细胞，又因为B蛋白和A receptor结合，所以楼主认为在收到的B蛋
白阳性的细胞中应该有A receptor表达，于是检测A receptor，但无法检测到结果。
我对此有如下问题：
1. B蛋白在细胞膜上吗？
2. 在该细胞系中B蛋白是稳定表达的吗？每个细胞？每个时刻？
3. 楼主在实验2中如何检测A receptor？WB？
我看不出来IP的结果为什么能说明表达B蛋白的细胞中一定有A receptor的表达。 |
D*a
发帖数: 6830 | 7 B蛋白没有agonist吗，或者是的突变过的B蛋白，那种结合下去不下来的。你自然的B蛋
白谁知道它怎么作用的 |
h****k
发帖数: 182 | 8 不好意思。 B蛋白是纯化后的重组蛋白，我们觉得它可能是A receptor的ligand..A
receptor表达在细胞膜上，A receptor有加了tag, 用anti-tag antibody染色做流式细
胞仪检测到的。
【在 T*****e 的大作中提到】
: 我总结一下楼主的实验，看看我有没有理解：
: 1. 在某细胞系中有B蛋白，楼主在其中表达一个A receptor，并假定AB有直接的蛋白相
: 互作用（连接）。于是楼主做co-IP，用识别B蛋白的抗体拉复合物，在该复合物中可以
: 检测到A蛋白（抗体识别，我自己脑补的）。
: 2. 楼主想进一步验证该结合，或者其他目的（筛选，测序等等）。于是在上述细胞系
: 中（有B蛋白，部分细胞可能转染了A receptor），对该细胞系进行染色（我不知道什
: 么是surface staining），楼主默认B蛋白在细胞膜上（我脑补的），所以该染色可以
: 标记所有带B蛋白的细胞，又因为B蛋白和A receptor结合，所以楼主认为在收到的B蛋
: 白阳性的细胞中应该有A receptor表达，于是检测A receptor，但无法检测到结果。
: 我对此有如下问题：
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l***i
发帖数: 36 | 9 毕竟B不是抗体，在不知道A，B相互作用强弱的情况下用flow很难检测到，相对于flow
，IP后用WB检查具有更高的sensitivity，并且很多非特异作用的蛋白，可以通过分子
量大小与目标蛋白区别开，而这些非特异的background，在flow染色和检测中仍然存在
。我建议你可以考虑尝试类似于ELISA的检测方法。 |
c**********n
发帖数: 177 | 10 如果非要做流式，换成B的tetramer或者pentamer做也许可以。表面受体和ligand的
affinity一般都不高，很多都是到uM级别。 |
s*****g
发帖数: 7857 | 11 IP/WB
免疫荧光照相（活体或固定的）
流矢细胞检测虽然快，但我总觉得不敏感。容易有非特异染色干扰。
最近我也在探讨两个信号分子在细胞膜上是否有co-localization。很不容易。因为悬
浮细胞，而且是快速反应。。。 |
v**********m
发帖数: 5516 | 12 pull down: A~x1~x2~xn~B, A'~B or the combos of both in the whole lysate.
cell surface, only A extracellular domains at certain conformation are
available for B.
plus, binding kinetics is different between these two.
Binding is a sum of chemical interactions. These experiments need more
elaborated
ideas.
B
stain
【在 h****k 的大作中提到】
: 在cell line上表达A receptor, 用B蛋白IP, A 能被pull down. 但是用B蛋白染色这个
: 表达A receptor的 cell line却染不上，有人遇到过这种情况吗？如何解释？
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