P****R
发帖数: 22479 | 1 1 北京大学生命科学学院魏文胜课题组
我们使用了文章中报道的高效ssDNA，同时自己设计了其他2条针对体内其他基因位点的
ssDNA，与NgAgo表达质粒共转HEK293T细胞与HeLa细胞，2天及5天后，用T7E1检测切割
效率，这三条针对2个不同基因的ssDNA，在HEK293T和HeLa两个细胞系中，无论转染一
次还是在8到12小时后再转染一次ssDNA，都没有检测到切割。
针对敲除后能使细胞有表型变化的某特定基因，我们设计了ssDNA，与NgAgo表达质粒共
转HeLa细胞5天后，发现细胞表现出了一定的对应表型，但是把这部分细胞收集起来提
取基因组，对靶位点测序，没有发现基因组序列的任何改变。
我们针对某特定基因设计了6种ssDNA，用特异的荧光报告系统检测是否有靶点DSB产生
，结果显示所有实验组均没有检测到对靶位点DNA序列的切割活性。
2 中科院动物研究所王皓毅课题组
我们在293T细胞中表达带有Flag标签的NgAgo ，在不同时间点检测NgAgo蛋白表达。发
现转染6小时后开始检测到目的蛋白，随着时间的延长蛋白量增加。在人类293T细胞系
中重复原文章中Figure 4b中NgAgo对DYRK1A和GATA4两个位点的基因编辑，使用文章中
发表的guide DNA (gDNA)。具体实验方法为NgAgo分别与相应的gDNA共转染细胞，6h、
12h后进行相应gDNA的再次转染。转染后3-4天收集细胞进行Surveyor assay，未检测到
目标位点目的条带的切割, 测序也未发现突变。结果未能重复Figure 4b。
我们也进行了原文章里的Figure 3切割GFP质粒的实验，使用文章中的eGFP gDNA G3，
转染2天后，观察荧光表达和进行流式检测， NgAgo+gDNA G3，NgAgo+ 靶向其他位点的
gDNA ，pUC19+G3， pUC19+5’端没有磷酸化修饰的gDNA，以及单独转染gDNA 都能够明
显降低eGFP表达。针对质粒目标位点的genotyping（Surveyor assay，PCR以及测序）
，未检测出任何突变。结果未能重复Figure 3 .
我们所使用的细胞定期进行支原体检测，未发现任何细胞污染。
3 中科院上海生科院生化与细胞所李劲松课题组
我们主要做了两方面的实验：一个是在Oct4-EGFP的小鼠受精卵中进行NgAgo mRNA和
gDNA的注射，尝试了不同的浓度组合，在囊胚的时候也有看到不亮或者发光很弱的情况
，但是测序发现序列并没有突变；另一个是在细胞水平，我们最初是在Oct4-EGFP的单
倍体细胞共转NgAgo和gDNA载体，分选双阳性的细胞直接测序或者培养后测序，均没有
突变。我们开始怀疑NgAgo的表达窗口比较窄，就改造载体建立了稳定表达Ago的细胞系
，依然没有突变。后面我们就完全按照NBT文章里的实验，在293T细胞中打靶hDYRK1基
因，gDNA的长度位置都和文章一样，还是没有能突变。
4 浙江大学声明科学研究院王立铭课题组
我们实验室在韩春雨论文发表一周内就索取了NgAgo的DNA载体，并立刻计划了对NgAgo
方法的测试。在两个月多达上百次的实验中，在我们测试的所有条件中，我们都没有观
察到NgAgo方法对果蝇基因组的编辑活性。
5 北京大学生命科学学院孙育杰课题组
我们使用了原始菌里来源的和人工合成的密码子优化的NgAgo，尝试了公司合成的磷酸
化gDNA和自己使用PnK磷酸化的gDNA切割MDA_MB-231细胞中的laminB1和LBR基因，每个
基因五条gDNA，通过T7 assay均未见切割。同时，我们切割整合在基因组的gfp基因，
使用韩春雨文章所用的gDNA，流式检测也无gfp荧光的下降。我们还将NgAgo融合了荧光
蛋白，使用靶向telomere的gDNA，使用高倍荧光显微镜没有发现NgAgo在telomere处的
富集。
6 中科院动物研究所李伟课题组
我们在哺乳动物细胞和胚胎水平进行了基于NgAgo的基因组靶向突变实验，采用了包括
韩文章中报道的293细胞和4个完全相同的guide序列和，结果均为阴性，均没有检测到
靶向DNA突变产生。具体进行的实验包括：1、利用体外原核表达纯化的NgAgo和韩文章
中报道的4个guide序列进行37°单链DNA切割，结果：37°没有检测到DNA切割。2、哺
乳动物细胞实验。按照文章附件中的方法，在293细胞分别转染韩文章中的 G5,G10,G27
,G28和自己设计的Mecp2基因guide序列，T7EI酶切检测没有检测到靶位点突变。进行
guide-DNA连续转染实验，在转染后8h,12h 补充转染guide 依然没有检测到靶位点的突
变。3、小鼠胚胎实验：选取Mecp2和stella 位点分别设计若干guide序列，连同NgAgo
mRNA一起进行细胞质注射，收取囊胚检测，T7EI和测序分析均没有检测到靶位点突变。
7 中科院上海生科院神经科学研究所研究员杨辉课题组
我们针对小鼠胚胎的GFP基因、Tyr基因分别设计了四个gDNA（在三家公司都试过合成了
），NgAgo用了三种不同版本（密码子优化或者NLS在N端、C端），操作几百个胚胎，生
了三百多只小鼠，都没有检测到敲除。之后我们又在细胞水平针对猴的Tyr基因、293的
GFP基因、N2A的Tyr基因进行操作，也没有检测到任何基因编辑。最后我们完全按照韩
文章中fig4的DYRKIA基因进行操作，也完全没有效果。
8 上海交通大学吴强课题组
TtAgo被发现在高温下可以在体外通过gDNA指引内切单链DNA，PfAgo在高盐条件下可以
切DNA单链，NgAgo可能是一种嗜盐碱古杆菌中含有类似RNaseH结构域的单链RNA内切酶
，但也可能内切DNA单链。我们利用密码子优化后合成的NgAgo做了以下体内编辑实验，
我们没有做体外实验：
1 单位点：不管是人工合成的5‘端磷酸化gDNA，还是利用T4 PNK磷酸激酶磷酸化5’端
羟基得到的gDNA，在小鼠胚胎、小鼠N2A细胞、人HEC-1B细胞中均没检测到活性。
2. 双位点：三个学生花的力气最大。至少做了三个不同的DNA片段，做了不同温度、盐
离子浓度、多次转染、先体外合成NgAgo蛋白再转染、不同的Tag或核定位序列，也试了
不同的细胞系。我们是用PCR检测DNA大片段敲除，这个方法很灵敏（用CRISPR/Cas9很
容易做出来），因为只有在片段敲除的情况下才能扩增出PCR产物，哪怕效率很低也应
该能检测出来。PCR产物经过克隆再测序，但从没有检测出片段敲除的正确结果。
9 温州医科大学谷峰课题组
我们利用携带GFP的人类细胞，同时导入磷酸化的gRNA和NgAgo表达质粒（做了多个不同
浓度梯度和重复），希望特异的看GFP敲除，以CRISPR/Cas9做阳性对照，但是NgAgo组
我们没有能够检测到GFP的失活。这个实验我们后面又重复了，但是仍然没有看到切割
。所以此时，我们高度怀疑NgAgo的活性，该项目就先停了。 |
l**k
发帖数: 22 | 2 总结就是无论in vitro还是in vivo，无论质粒还是内源基因，没一个结果能重复出来
。怪不得这么多人实名出来说，这结果比我想象的还糟糕。我还以为他做出体外才编的
体内，这特么从头到尾都是脑补的啊。 |
c********n
发帖数: 225 | 3 【再贴一次】
对于韩春雨NBT文章无法重复的问题
需要从Figure 1 开始一步步看
作者的contributions
1. C.H. conceived the study and designed the experiments.
文章 “Story” “Idea” 的设计与发起人
2. X.Z.S. provided intellectual advice on the project and experimental
design.
实验设计， “One guide-faithful” -Figure 2d？
3. C.H. performed mammalian genome editing.
（Figure 4,5）
文章里让科研界最感兴趣的结果，也是无法被重复验证的主要问题
4. F.G. performed the BLAST search and the in vitro cleavage experiments.
（Figure 1, Figure 2？，Figure 3a，supplementary figure 2）
大肠杆菌E coli 表达的蛋白
NgAgo 基因编辑功能的初步 in vitro 数据支持
注：文章中缺乏蛋白表达纯化的数据
注：按韩春雨NBT文章一样的条件设置，中国研究人员无法重复Figure 3
5. F.G., F.J. and Y.W. designed and constructed the clones under the
supervision of C.H.
在韩春雨指导下，学生们设计并做的constructs
注：文章中所有的constructs 看来都是学生们在韩春雨指导下做出来的
6. F.J. and Y.W. performed the in vivo cleavage experiments.
（Figure 3b，3c, 3d）
哺乳细胞表达的蛋白
NgAgo 基因编辑功能的初步 in vitro 及 in vivo 数据支持
注：文章中缺乏蛋白表达纯化的数据
注：文章中缺乏蛋白细胞内定位的数据以及实验详细步骤
注：按韩春雨NBT文章一样的条件设置，中国研究人员无法重复Figure 3
7. X.Z.S. and C.H. wrote the manuscript.
“Story”的编写者们
文章图片分析：
1. Figure 1 E coli GST-NgAgo，in vitro assay
- E coli 表达纯化的是 GST-NgAgo， NBT正文以及supplementary中，存在有关于蛋白
表达的数据吗？ - 没有找到
- Figure 1b：
E coli expressed NgAgo with either FW or RV guide DNA： nicked target
plasmid （Lanes 5,6）
E coli expressed NgAgo with both FW and RV guide DNA： linearized target
plasmid （Lane 7）
- 支持Figure 1 的数据有 supplementary Figure 2
E coli NgAgo （assuming GST-NgAgo) 55C preloaded with guide
(没有注明是FW or RV guide), 只能nick plasmid
2. Figure 2 Mammalian， FLAG-NgAgo-HA？
- HEK293T 表达纯化的是 FLAG-NgAgo-HA， NBT正文以及supplementary中，存在有关于
蛋白表达的数据吗？ - 没有找到
- 这张图是“one guide faithful”原理的数据来源
- Figure 2a ssDNA很泛泛，没有注明是否是 FW+RV
- Figure 2b 注明了是FW guide
3. Figure 3 Mammalian FLAG-NgAgo-HA
- Figure 3a：
HEK293T expressed NgAgo preloaded with FW guide alone： linearized plasmid
（Lanes 1,2,3）
这和Figure 1b 矛盾 也和supplementary figure 2 有矛盾
- 支持Figure 3a 的数据有 supplementary Figure 1
也是只要preloaded with FW guide就可以 linearized plasmid
这和Figure 1b 矛盾 也和supplementary figure 2 有矛盾
- HEK293T 表达纯化的是 FLAG-NgAgo-HA， NBT正文以及supplementary中，存在有关于
蛋白表达的数据吗？ - 没有找到
4. Supplementary Figure 4
文章中唯一的关于NgAgo 在哺乳细胞中定位的数据
- Hela cell 表达的NLS-NgAgo蛋白localized to nucleus
- 这个NLS-NgAgo 蛋白是如何被检测到的？
- 原文引用
“NgAgo is directed into nucleus by NLS.
The engineered NLS-NgAgo was transfected to Hela cells and it shows that the
expressed NLS-NgAgo was compartmented in the
nucleus (DAPI+) and the cells maintained normal morphology. Scale bar = 100
μm. Representative figure of 20 independent
experiments.” |
l********7
发帖数: 175 | 4 谁批准这些人做这些项目的，这些资金从哪些项目里出的？资金被挪用没法交代了，现
在找主席的要钱。 |
S******g
发帖数: 3 | |
a*****g
发帖数: 19398 | 6 你不发现，不等于别人没发现，这个道理还是明白吧
【在 P****R 的大作中提到】
: 1 北京大学生命科学学院魏文胜课题组
: 我们使用了文章中报道的高效ssDNA，同时自己设计了其他2条针对体内其他基因位点的
: ssDNA，与NgAgo表达质粒共转HEK293T细胞与HeLa细胞，2天及5天后，用T7E1检测切割
: 效率，这三条针对2个不同基因的ssDNA，在HEK293T和HeLa两个细胞系中，无论转染一
: 次还是在8到12小时后再转染一次ssDNA，都没有检测到切割。
: 针对敲除后能使细胞有表型变化的某特定基因，我们设计了ssDNA，与NgAgo表达质粒共
: 转HeLa细胞5天后，发现细胞表现出了一定的对应表型，但是把这部分细胞收集起来提
: 取基因组，对靶位点测序，没有发现基因组序列的任何改变。
: 我们针对某特定基因设计了6种ssDNA，用特异的荧光报告系统检测是否有靶点DSB产生
: ，结果显示所有实验组均没有检测到对靶位点DNA序列的切割活性。
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P****R
发帖数: 22479 | 7 你国科学家虽然不懂怎样重复自己发表的实验，但是显然很懂中国：混进政协有了护身
符，弟子评上副教授，校长要升官，科研经费也套下来了。成功绑架体制，一损俱损，
一荣俱荣。于是可以理直气壮地宣布：俺辛辛苦苦凭本事造假，为什么要自证清白？！
【在 a*****g 的大作中提到】
: 你不发现，不等于别人没发现，这个道理还是明白吧
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l********7
发帖数: 175 | 8 这几个当中那个赔钱赔的最多？偷鸡不成蚀把米。尤其是上海神经所的那位简直就是一
神经X，真有钱，就是没脑子，还好意思写出来丢人显眼。别人都是做个关键试验不成
功就放下了，他这是赌徒心理，想干票大的，没想到被忽悠到裤衩都露出来了，可惜做
试验的那些孩子啦。 |
P****R
发帖数: 22479 | 9 从仇发表的方式看，这个人的科学基本训练很差，怎么混进神经所去的？
【在 l********7 的大作中提到】
: 这几个当中那个赔钱赔的最多？偷鸡不成蚀把米。尤其是上海神经所的那位简直就是一
: 神经X，真有钱，就是没脑子，还好意思写出来丢人显眼。别人都是做个关键试验不成
: 功就放下了，他这是赌徒心理，想干票大的，没想到被忽悠到裤衩都露出来了，可惜做
: 试验的那些孩子啦。
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l********7
发帖数: 175 | 10 让手下做老鼠和猴子实验那位更离谱，一群神马鸟人。
【在 P****R 的大作中提到】
: 从仇发表的方式看，这个人的科学基本训练很差，怎么混进神经所去的？
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g********0
发帖数: 6201 | 11 说明中国科研人员缺乏独立思考，全靠山寨和盲目试错的落后科研方式。 |
