e****e
发帖数: 1042 | 1 现在需要把yeast extract里面的protein含量测出来。我们要的是其中的peptide。但
是想知道里面protein的杂质的量。请问什么assay可以测出来？Bradford protein
assay和Bio-rad protein assay 应该是区分不出peptide和protein的吧？谢谢指教！ |
s******s
发帖数: 13035 | 2 你这个protein和peptide啥定义啊
【在 e****e 的大作中提到】
: 现在需要把yeast extract里面的protein含量测出来。我们要的是其中的peptide。但
: 是想知道里面protein的杂质的量。请问什么assay可以测出来？Bradford protein
: assay和Bio-rad protein assay 应该是区分不出peptide和protein的吧？谢谢指教！
|
e****e
发帖数: 1042 | 3 就大小不一样呗！我要的产物是3kD左右的peptide，其它的都是杂质，我想知道比如大
于10kD的protein的量是多少，就算是protein的杂质量。我不需要分离它们。
【在 s******s 的大作中提到】
: 你这个protein和peptide啥定义啊
|
s******r
发帖数: 2876 | 4 比如说，平均分成两份，一份透析，一份不透析，再比较有没有差别。
【在 e****e 的大作中提到】
: 现在需要把yeast extract里面的protein含量测出来。我们要的是其中的peptide。但
: 是想知道里面protein的杂质的量。请问什么assay可以测出来？Bradford protein
: assay和Bio-rad protein assay 应该是区分不出peptide和protein的吧？谢谢指教！
|
e****e
发帖数: 1042 | 5 这个太繁了，而且我们是工业化生产。步骤里面包括透析（我们用的是TFF），但是在
filtration前后，我都要用一种方法来测蛋白质杂质的量。start material 我就要测
蛋白杂质的量，不能增加透析这么复杂的步骤。
这就是工业生产跟实验室的区别之一。实验室里可以用很多步骤来得到一个精确的结论
，但是在工业化的生产里面，就是工程中多用一倍的水量，都会被认为是不现实。
【在 s******r 的大作中提到】
: 比如说，平均分成两份，一份透析，一份不透析，再比较有没有差别。
|
b******y
发帖数: 627 | 6 3 kD is about 30 a.a. chemical synthesis is much easier. |
b******y
发帖数: 627 | 7 I guess that products from yeast extract have easier time to get through FDA
regulation. |
e****e
发帖数: 1042 | 8 我们是工业化生产，成本很重要。
【在 b******y 的大作中提到】
: 3 kD is about 30 a.a. chemical synthesis is much easier.
|
a***e
发帖数: 1010 | |
s******y
发帖数: 28562 | 10 你们国内的人怎么最近频频出现啊？是不是GFW好久没有升级了？
【在 a***e 的大作中提到】
: HPLC ?
|
|
|
s******y
发帖数: 28562 | 11 Using FPLC, HPLC, or Mass Spec 来分离大分子和小分子。
又快又简单，就是对器材要求高一些。
【在 e****e 的大作中提到】
: 这个太繁了，而且我们是工业化生产。步骤里面包括透析（我们用的是TFF），但是在
: filtration前后，我都要用一种方法来测蛋白质杂质的量。start material 我就要测
: 蛋白杂质的量，不能增加透析这么复杂的步骤。
: 这就是工业生产跟实验室的区别之一。实验室里可以用很多步骤来得到一个精确的结论
: ，但是在工业化的生产里面，就是工程中多用一倍的水量，都会被认为是不现实。
|
e****e
发帖数: 1042 | 12 Thanks for your suggestion! But we currently already use HPLC to quantify
our peptide product. Protein cannot be quantified by FPLC\HPLC, right? I'm
not sure about Mass spec though.
【在 s******y 的大作中提到】
: Using FPLC, HPLC, or Mass Spec 来分离大分子和小分子。
: 又快又简单，就是对器材要求高一些。
|
o****u
发帖数: 214 | 13 工业化生产又如何呢？还不是一样可以从反应器里面取小样测定。谁也没让你把所有的
反应液都拿去透析啊。
用个浓缩蛋白的１０k column，离心一下，去掉多肽。剩下的就是蛋白了。然后用常规
方法测一下剩余蛋白含量。做个减法就可以估算多肽含量了。
当然如果你的反应液均一性不行的话另说。如果可能的话，尽量写详细点，不然我们也
没法帮你。
【在 e****e 的大作中提到】
: 这个太繁了，而且我们是工业化生产。步骤里面包括透析（我们用的是TFF），但是在
: filtration前后，我都要用一种方法来测蛋白质杂质的量。start material 我就要测
: 蛋白杂质的量，不能增加透析这么复杂的步骤。
: 这就是工业生产跟实验室的区别之一。实验室里可以用很多步骤来得到一个精确的结论
: ，但是在工业化的生产里面，就是工程中多用一倍的水量，都会被认为是不现实。
|
o****u
发帖数: 214 | 14 另外，这个3k的肽是sequence specified特定的肽，还是mixture？
【在 e****e 的大作中提到】
: 就大小不一样呗！我要的产物是3kD左右的peptide，其它的都是杂质，我想知道比如大
: 于10kD的protein的量是多少，就算是protein的杂质量。我不需要分离它们。
|
s******y
发帖数: 28562 | 15 咦？ 有何不可呀？你这个问题的实际就是要把蛋白和小肽分开，所以HPLC/HPLC
是最简单也最经典的方法（我猜你是学化学的？所以没有这么做过？）
用个比较小的resin，比方说Sephedex G-10, 几乎所有蛋白都在dead volume 里面
（就是第一个峰）流出来了。然后后面的峰就是peptide 了。要定量的话太简单了，
最直接的就是看OD280 和 OD230， 要更精确的话就把管子里的东西一一拿去测
bradford,
甚至你要上碳定量或者氮定量都行。
Mass Spec 对于小量的污染很敏感，可以用来检测残留物，但是定量性不好。
【在 e****e 的大作中提到】
: Thanks for your suggestion! But we currently already use HPLC to quantify
: our peptide product. Protein cannot be quantified by FPLC\HPLC, right? I'm
: not sure about Mass spec though.
|
i***l
发帖数: 1656 | 16 re this, test a small amount and scale up
i like filtration column, easy to handle,
【在 o****u 的大作中提到】
: 工业化生产又如何呢？还不是一样可以从反应器里面取小样测定。谁也没让你把所有的
: 反应液都拿去透析啊。
: 用个浓缩蛋白的１０k column，离心一下，去掉多肽。剩下的就是蛋白了。然后用常规
: 方法测一下剩余蛋白含量。做个减法就可以估算多肽含量了。
: 当然如果你的反应液均一性不行的话另说。如果可能的话，尽量写详细点，不然我们也
: 没法帮你。
|
a****k
发帖数: 1130 | 17 不是有那种离心的管子，中间有个filter的那种，经常被我们用来concentrate蛋白的
，filter cut-off是10k的很常见吧，3k的应该也有吧
【在 e****e 的大作中提到】
: 现在需要把yeast extract里面的protein含量测出来。我们要的是其中的peptide。但
: 是想知道里面protein的杂质的量。请问什么assay可以测出来？Bradford protein
: assay和Bio-rad protein assay 应该是区分不出peptide和protein的吧？谢谢指教！
|
s******s
发帖数: 13035 | 18 millipore有很多。
【在 a****k 的大作中提到】
: 不是有那种离心的管子，中间有个filter的那种，经常被我们用来concentrate蛋白的
: ，filter cut-off是10k的很常见吧，3k的应该也有吧
|
e****e
发帖数: 1042 | 19 According to your opinion, I should use Bradford assay to determine total
protein and peptide. I will get the total amount of my peptide product from
HPLC. Then the protein amount is total protein and peptide minus the amount
of my peptide product. Dialysis is not necessary, right?
【在 o****u 的大作中提到】
: 工业化生产又如何呢？还不是一样可以从反应器里面取小样测定。谁也没让你把所有的
: 反应液都拿去透析啊。
: 用个浓缩蛋白的１０k column，离心一下，去掉多肽。剩下的就是蛋白了。然后用常规
: 方法测一下剩余蛋白含量。做个减法就可以估算多肽含量了。
: 当然如果你的反应液均一性不行的话另说。如果可能的话，尽量写详细点，不然我们也
: 没法帮你。
|
e****e
发帖数: 1042 | 20 Sequence specified.
【在 o****u 的大作中提到】
: 另外，这个3k的肽是sequence specified特定的肽，还是mixture？
|
|
|
y******n
发帖数: 8667 | 21
Gel Filtration Chromatography (Size-exclusion chromatography)
【在 e****e 的大作中提到】
: Thanks for your suggestion! But we currently already use HPLC to quantify
: our peptide product. Protein cannot be quantified by FPLC\HPLC, right? I'm
: not sure about Mass spec though.
|
e****e
发帖数: 1042 | 22 No. I came from biochemistry labs. So can I get an conclusion that there is
no a method can detect only the amount of protein but peptide? Of course I
have a method to detect the amount of the peptide product.
【在 s******y 的大作中提到】
: 咦？ 有何不可呀？你这个问题的实际就是要把蛋白和小肽分开，所以HPLC/HPLC
: 是最简单也最经典的方法（我猜你是学化学的？所以没有这么做过？）
: 用个比较小的resin，比方说Sephedex G-10, 几乎所有蛋白都在dead volume 里面
: （就是第一个峰）流出来了。然后后面的峰就是peptide 了。要定量的话太简单了，
: 最直接的就是看OD280 和 OD230， 要更精确的话就把管子里的东西一一拿去测
: bradford,
: 甚至你要上碳定量或者氮定量都行。
: Mass Spec 对于小量的污染很敏感，可以用来检测残留物，但是定量性不好。
|
e****e
发帖数: 1042 | 23 Gel Filtration Chromatography shows a flat peak starting from the void
volumn to the end. Yeast extract is quite dirty.
【在 y******n 的大作中提到】
:
: Gel Filtration Chromatography (Size-exclusion chromatography)
|
e****s
发帖数: 1125 | 24 其实艳阳天说的方法很好。
你就测总蛋白，Braford之类。然后通过Gel filtration分离Peptide一定量总蛋白里面
的量。比如上10mg的蛋白，然后回收Peptide峰，通过A280算出Peptide量。这样
Peptide在总蛋白中占多少比例不是很清楚了？
精确测蛋白浓度是很麻烦的，一般都是相对浓度。不论是Braford还是A280都存在不同
蛋白间的差异。
is
【在 e****e 的大作中提到】
: No. I came from biochemistry labs. So can I get an conclusion that there is
: no a method can detect only the amount of protein but peptide? Of course I
: have a method to detect the amount of the peptide product.
|
e****s
发帖数: 1125 | 25 上样量太大了！？有条件弄长点的柱子。
【在 e****e 的大作中提到】
: Gel Filtration Chromatography shows a flat peak starting from the void
: volumn to the end. Yeast extract is quite dirty.
|
y******n
发帖数: 8667 | 26
你是说蛋白量大还是量小？还是你说直接上的打碎的细胞？打碎的细胞里面那么多杂带
，你怎么可以分析？
你需要说详细点你要检验什么？来源是什么？是提纯的还是没有经过粗提纯的？如果是
Yeast extract，你应该只能用Western Blot来看你蛋白在不在吧？
【在 e****e 的大作中提到】
: Gel Filtration Chromatography shows a flat peak starting from the void
: volumn to the end. Yeast extract is quite dirty.
|
y******n
发帖数: 8667 | 27 才明白你是在Yeast extract里？根本没有粗提纯？那东西怎么能用来测蛋白比例含量
的？至少你先用离心加盐沉淀把蛋白搞到吧？细胞里的杂蛋白上百条，你那个如果是过
量表达(Overexpressed)的，至少先跑SDS-PAGE确定大致含量吧？
其实根据的带的深浅粗细已经可以估算大致的量了。如果带根本看不见，你只有用来确
定是否有，或用抗体亲和柱来分离和估算结合柱上的或流出的蛋白大致量。 |
o****u
发帖数: 214 | 28 我倒是很好奇。你这个３k的多肽是过表达的还是原生的。如果是过表达，还真是满厉
害的。
另外，我以前也认为工业化的东西很神秘。后来和公司做得多了，才发现其实好多
protocol也是学术圈的人帮忙设计的。从纯科研实验室到公司实验室有些思维要稍微转
化一下，至少很多kit是不能用的。如果是正规公司，有些非标准的pcr都不能用，因为
涉及到专利问题。但至少到中试为止，工业圈比学术圈好点的也就是多一些know-how的
东西，核心层面的谁也不比厉害多少。当然真正到了full scale生产的时候，涉及管理
层面的东西，搞学术的一般就不行了。
我倒是做过相关的项目。但是从你目前提供的信息来看，很难具体的帮你分析，比如用
的是什么strain,粗提方法是什么等等。但是如果你是工业项目，估计你也很难把所有
的东西都写上来。如果你还想从这里得到帮助，自己把握尺度，再多提供点信息吧。
【在 e****e 的大作中提到】
: Sequence specified.
|
e****e
发帖数: 1042 | 29 I already got what I need to know. My question is very simple. That is, is
there any method can measure only protein but no peptide without further
seperation or purification? I thought the answer should be "No" before I
came here. But I am not so sure since I never think about it before. When I
worked in purification labs, we always used OD280 to determine protein
concentration since the protein is quite pure. When I worked in molecular
biology lab, we always used Bradford to determine the protein concentration
of whole cell lysate. When I worked in manufacturing labs, HPLC is used to
determine small molecular concentration. But I never think all these detect
methods together.
All the above suggestions confirm my answer since the definition between
protein and peptide is not distinct. Of course I know the purification
method for seperating the peptide from proteins or the yeast extract well.
So I can't help smiling when I saw those that suggest to do dialysis.
【在 o****u 的大作中提到】
: 我倒是很好奇。你这个３k的多肽是过表达的还是原生的。如果是过表达，还真是满厉
: 害的。
: 另外，我以前也认为工业化的东西很神秘。后来和公司做得多了，才发现其实好多
: protocol也是学术圈的人帮忙设计的。从纯科研实验室到公司实验室有些思维要稍微转
: 化一下，至少很多kit是不能用的。如果是正规公司，有些非标准的pcr都不能用，因为
: 涉及到专利问题。但至少到中试为止，工业圈比学术圈好点的也就是多一些know-how的
: 东西，核心层面的谁也不比厉害多少。当然真正到了full scale生产的时候，涉及管理
: 层面的东西，搞学术的一般就不行了。
: 我倒是做过相关的项目。但是从你目前提供的信息来看，很难具体的帮你分析，比如用
: 的是什么strain,粗提方法是什么等等。但是如果你是工业项目，估计你也很难把所有
|
o****u
发帖数: 214 | 30 我说你还先不要笑话其他人。
我不久前才给公司设计了一个在大型反应器里面测蛋白含量的方案。当然不是直接测多
肽的。最后用的是一个很老但是很简单的方法。
对于这种工业用protocol的设计，我的经验是双方要坐下来好好谈具体细节，比如说你
的粗提物的大致蛋白杂质含量,需要测定有多高的精度,然后才能设计成功的。像你这样
很模糊的提问题，是很难得到准确的解决方法的。
另外，如果可能的话，能大致讲一下3k的多肽是怎么过表达的吗？
I
concentration
detect
【在 e****e 的大作中提到】
: I already got what I need to know. My question is very simple. That is, is
: there any method can measure only protein but no peptide without further
: seperation or purification? I thought the answer should be "No" before I
: came here. But I am not so sure since I never think about it before. When I
: worked in purification labs, we always used OD280 to determine protein
: concentration since the protein is quite pure. When I worked in molecular
: biology lab, we always used Bradford to determine the protein concentration
: of whole cell lysate. When I worked in manufacturing labs, HPLC is used to
: determine small molecular concentration. But I never think all these detect
: methods together.
|
|
|
e****e
发帖数: 1042 | 31 Asking an open question means I want to open my mind. I don't need you to
solve my problem. That's my job.
【在 o****u 的大作中提到】
: 我说你还先不要笑话其他人。
: 我不久前才给公司设计了一个在大型反应器里面测蛋白含量的方案。当然不是直接测多
: 肽的。最后用的是一个很老但是很简单的方法。
: 对于这种工业用protocol的设计，我的经验是双方要坐下来好好谈具体细节，比如说你
: 的粗提物的大致蛋白杂质含量,需要测定有多高的精度,然后才能设计成功的。像你这样
: 很模糊的提问题，是很难得到准确的解决方法的。
: 另外，如果可能的话，能大致讲一下3k的多肽是怎么过表达的吗？
:
: I
: concentration
|
o****u
发帖数: 214 | 32 如果你不是来咨询问题的，那我就没什么好说的了。
其实你一开始问这个问题的时候，我就觉得奇怪，为什么要从提取液而不是培养液中提
取多肽
当然我还是很佩服你们能做到3k多肽在胞体中的过表达的。
【在 e****e 的大作中提到】
: Asking an open question means I want to open my mind. I don't need you to
: solve my problem. That's my job.
|
s******y
发帖数: 28562 | 33 我明白你的意思了。
你本来就是想看看有什么最新的特别fancy 的技术可以不通过分离而直接
挑出peptide or protein来特异反应啊。
那还真的没有这种技术。
因为蛋白本来就和peptide 没有啥严格区别。
is
【在 e****e 的大作中提到】
: No. I came from biochemistry labs. So can I get an conclusion that there is
: no a method can detect only the amount of protein but peptide? Of course I
: have a method to detect the amount of the peptide product.
|
e****e
发帖数: 1042 | 34 Yes, you are right! Thanks anyway. You are so warmhearted!
【在 s******y 的大作中提到】
: 我明白你的意思了。
: 你本来就是想看看有什么最新的特别fancy 的技术可以不通过分离而直接
: 挑出peptide or protein来特异反应啊。
: 那还真的没有这种技术。
: 因为蛋白本来就和peptide 没有啥严格区别。
:
: is
|
e****e
发帖数: 1042 | 35 As I said before, I've worked on protein projects for a long time. But I
never think too much. Once a person who never works on this field ask such
an question, I lost for a moment. Just like when a kid saw a piece of white
paper turns to black when the paper was burned, he asked why the white turns
to the black. I told the kid the fire make the paper to carbon. Then the
kid said: "So the paper is not carbon?" I suddenly realized the paper is
also made of wood and it should be carbon. Then I need to think more and
explain more. hehe, I am not sure if this is other similar example. If not,
then just for sharing some funny things.
Seriously, I don't understand why you think 3kD peptides will be difficult
to be over-expressed. I didn't work on this peptide's expression. But
according to my previous experience, couples of 5 to 9 kD proteins in my
hand are very easy to over-express in E.Coli.
【在 o****u 的大作中提到】
: 如果你不是来咨询问题的，那我就没什么好说的了。
: 其实你一开始问这个问题的时候，我就觉得奇怪，为什么要从提取液而不是培养液中提
: 取多肽
: 当然我还是很佩服你们能做到3k多肽在胞体中的过表达的。
|
o****u
发帖数: 214 | 36 呵呵，9k的不足为奇,5kd的如果能做到克级每升的表达量就非常历害了。不过我想应该
也能办到。
3k就是另一个层次的了.
就像你说的，这是多肰而不是蛋白了。技术上的难度和小蛋白的表达不可同日而语。
能说一下你在哪个公司吗。我对你们的技术很惑兴趣
white
turns
,
【在 e****e 的大作中提到】
: As I said before, I've worked on protein projects for a long time. But I
: never think too much. Once a person who never works on this field ask such
: an question, I lost for a moment. Just like when a kid saw a piece of white
: paper turns to black when the paper was burned, he asked why the white turns
: to the black. I told the kid the fire make the paper to carbon. Then the
: kid said: "So the paper is not carbon?" I suddenly realized the paper is
: also made of wood and it should be carbon. Then I need to think more and
: explain more. hehe, I am not sure if this is other similar example. If not,
: then just for sharing some funny things.
: Seriously, I don't understand why you think 3kD peptides will be difficult
|
b******y
发帖数: 627 | 37 This depends on what peptides you are talking about. Over the years, I have
produced multiple peptides (some are qualified as proteins, e.g. ww domains)
between 3-5 KDa in E. coli: some of them are disordered, some are single
helix and some are a few beta-strand. Many of them have very high yields. |
n********k
发帖数: 2818 | 38 hi, buddy, what define a protein or peptide, is it the size? 50-100aa?
have
domains)
【在 b******y 的大作中提到】
: This depends on what peptides you are talking about. Over the years, I have
: produced multiple peptides (some are qualified as proteins, e.g. ww domains)
: between 3-5 KDa in E. coli: some of them are disordered, some are single
: helix and some are a few beta-strand. Many of them have very high yields.
|
n********k
发帖数: 2818 | 39 BTW, are there anyway or people detecting the shorting ORF by looking for
peptides?
【在 n********k 的大作中提到】
: hi, buddy, what define a protein or peptide, is it the size? 50-100aa?
:
: have
: domains)
|
b******y
发帖数: 627 | 40 If you have a 50 a.a peptide with no particular 2nd structure, I call it a
peptide. Some polypeptides, like ww domains, have only about 40 a.a. (3
short beta strands packed in an antiparallel fashion), which can bind
proline-rich peptide ligands. I can call them proteins or at least protein
domains. I believe there are a few domains that are of comparable size or
even smaller than ww domains. Don't remember what they are called on top of
my head.
As we all know, it is so trivial to translate DNA to a.a. sequence. However,
it is harder to define ORF just based on translation into peptide because a
real ORF has to code a number of elements: promoter sequence for
transcription, initiation ATG-codon, ribosome entry site, poly-A signal, etc
. |
|
|
b******y
发帖数: 627 | 41 I think you meant milligrams per liter not grams per liter.
【在 o****u 的大作中提到】
: 呵呵，9k的不足为奇,5kd的如果能做到克级每升的表达量就非常历害了。不过我想应该
: 也能办到。
: 3k就是另一个层次的了.
: 就像你说的，这是多肰而不是蛋白了。技术上的难度和小蛋白的表达不可同日而语。
: 能说一下你在哪个公司吗。我对你们的技术很惑兴趣
:
: white
: turns
: ,
|
n********k
发帖数: 2818 | 42 but I was thinking about determining the existence of peptide and then
reverse to find potential ORF...feasible or not, any potential/progress in
this area
of
However,
a
【在 b******y 的大作中提到】
: If you have a 50 a.a peptide with no particular 2nd structure, I call it a
: peptide. Some polypeptides, like ww domains, have only about 40 a.a. (3
: short beta strands packed in an antiparallel fashion), which can bind
: proline-rich peptide ligands. I can call them proteins or at least protein
: domains. I believe there are a few domains that are of comparable size or
: even smaller than ww domains. Don't remember what they are called on top of
: my head.
: As we all know, it is so trivial to translate DNA to a.a. sequence. However,
: it is harder to define ORF just based on translation into peptide because a
: real ORF has to code a number of elements: promoter sequence for
|
b******y
发帖数: 627 | 43 Finally to LZ, you can quantify your product using HPLC at any stage of your
purification. Meanwhile measuring total protein including protein, peptide
and your product using branford or methods alike, you will know the
enrichment or purity at any stage. I believe this is more or less how your
company is doing it.
What makes me agitated is:
Even if you can magically distinguish 3 KDa peptides from 1-2.9 KDa and 3.1
KDa-infinite, you still don't know whether they are purely from your product
or partial from impurity. You knew this all along!? Why still keep
bothering us? |
b******y
发帖数: 627 | 44 You mean MS whole cell proteome and then determine ORF accordingly. Good
thought. I have to wait for bioinformatics experts to answer this question.
【在 n********k 的大作中提到】
: but I was thinking about determining the existence of peptide and then
: reverse to find potential ORF...feasible or not, any potential/progress in
: this area
:
: of
: However,
: a
|
o****u
发帖数: 214 | 45 毫克级的没什么好说的。一般来说,工业级至少要到百毫克级，才有继续优化的意义。
不然就没有什么商业价值了。
成熟的full scale的小蛋白或者说长多肽表达肯定是要到克级甚至是十克级的。
３k－8k这个长度其实是最难的。再短点可以化学合成，再长点按蛋白来表达也好说。
当然也不是完全不可能。比如胰岛素就是能做到前体肽段占所有cell mass的４０％这
样比较惊人的级别的。但是这是几十年的工业优化和机缘巧合才能做到。
这么说吧，药品级纯度的３k多肽，现在价格至少在１公斤１０万欧元(大部分的化药原
料的价格为数十到数百一公斤)。如果楼主这个项目能成，应该是非常有价值的。
【在 b******y 的大作中提到】
: I think you meant milligrams per liter not grams per liter.
|
o****u
发帖数: 214 | 46 完全同意。如果是瞄准的药物或者功能性多肽。hplc其实是必须的。有gmp标准的问题
。当然预研过程中，找点简单的方法还做初略估计是可以的。
我不知道楼主究竟做的是什么项目。不过我估计如果是工业项目，那么这个３k的多肽
的表达量至少应该是百毫克级别的，不太可能有太多比３k还小的多肽作为主要杂质。
因此，初提物里面应该主要是蛋白杂质。
当然我也是盲人摸象，就楼主提供的这么点信息，我也只能猜到这里了。
your
peptide
1
product
【在 b******y 的大作中提到】
: Finally to LZ, you can quantify your product using HPLC at any stage of your
: purification. Meanwhile measuring total protein including protein, peptide
: and your product using branford or methods alike, you will know the
: enrichment or purity at any stage. I believe this is more or less how your
: company is doing it.
: What makes me agitated is:
: Even if you can magically distinguish 3 KDa peptides from 1-2.9 KDa and 3.1
: KDa-infinite, you still don't know whether they are purely from your product
: or partial from impurity. You knew this all along!? Why still keep
: bothering us?
|
b******y
发帖数: 627 | 47 wow! good to know.
【在 o****u 的大作中提到】
: 毫克级的没什么好说的。一般来说,工业级至少要到百毫克级，才有继续优化的意义。
: 不然就没有什么商业价值了。
: 成熟的full scale的小蛋白或者说长多肽表达肯定是要到克级甚至是十克级的。
: ３k－8k这个长度其实是最难的。再短点可以化学合成，再长点按蛋白来表达也好说。
: 当然也不是完全不可能。比如胰岛素就是能做到前体肽段占所有cell mass的４０％这
: 样比较惊人的级别的。但是这是几十年的工业优化和机缘巧合才能做到。
: 这么说吧，药品级纯度的３k多肽，现在价格至少在１公斤１０万欧元(大部分的化药原
: 料的价格为数十到数百一公斤)。如果楼主这个项目能成，应该是非常有价值的。
|
o****u
发帖数: 214 | 48 其实我个人对这个项目非常好奇。
楼主说工业生产成本压力很大，一些常规的实验室技术不能应用，这是正确的。但是如
果连多用点水都要考虑过多，对3k多肽生产这样超高附加值的精细化工就是夸张了。
话说回来，3k-8k多肽的工业化生产其实是现阶段最难的。
现在3k多肽的主流工业生产还是化学法。药品市场90%以上种类的3k多肽都是合成的。
细胞重组表达的掰着手指都能数出来。前面我已经说了现在化学合成的3k多肽市场售
价是传统化药的数百倍乃至数千倍，大概在100欧元/克的水平。而一个能盈利的工业项
目，生产成本一般是不能超过终产品售价的30%的，因为还有运营，人员，税费，运输
和储藏等各种开支。多肽的工业化生产中，大约70%的成本是在粗产品的提纯，来达到
药用级别。也就是说，重组技术生产的粗提肽必须控制在10欧/克左右的水平。因此成
熟商业级的多肽制备都是至少克/升级的。如果在预研阶段没有百毫克级的表达，一般
的商业公司是不会下决心去做优化的。不然的话，连发酵成本都承受不起，更不要提后
面的提纯的下游成本。而且重组的多肽还有个很大的问题。就是重组多肽的C端是没有
保护的。一般还要通过化学法做c-terminal amidation.这个起码又是让成本翻番。
既然楼主说不能承受化学合成的价格。那么这个重组表达系统必然是超级过表达的。而
那么高的多肽过表达量在胞体里面实现对我来说确实是很值得振奋的。因为3k多肽这样
没有二级结构，不稳定的东西，如果在胞体中积累到百分几到几十的质量，是很难想象
的事。我所知道的重组多肽工业生产，要么是作为特异性包涵体沉淀下来，要么是
secret到发酵液中。而这两者，其实都没有什么严重的蛋白杂质。所以，那么多年，从
来也没人问过我要怎么快速简易区分多肽和蛋白的问题。因此我才很好奇，楼主他们到
底是怎么做到在yeast胞体中做到工业化级别的3k多肽表达的？当然，我估计这可能是
商业机密，楼主也不能到网上乱说的。
【在 b******y 的大作中提到】
: wow! good to know.
|
b******y
发帖数: 627 | 49 Thanks for sharing the info. Clearly, academia is totally different from
industry.
Out of curiosity, what kind of and how many drugs are made of peptide? |
o****u
发帖数: 214 | 50 从技术角度出发，其实学术研究和工业生产并不能算是totally different的。工业圈
的不仅是上游技术很多要依靠学术圈来供给，而且产品开发或者route scouting也不是
说学术圈的就参与不进去的。商业公司的真正的强项实际是在市场开发和准入注册这些
非常靠近下游的。生物公司里的核心技术人员有几个不是phd的，还不都是从学术圈里
面转过来的。所以其实很多时候只是一个观念转化的问题。
另外关于多肽的问题，据我所知，FDA批准的多肽药物大概是50种左右。最出名的
，当然是胰岛素。这个是重组生产的。另外还有一个24mer我知道能做到6g/L的级别，
原来也是化学合成的，是否生产已经换代，我不太清楚。剩下的3k左右的基本都是合成
的。重组方法还有一个致命缺点就是没法合成含D氨基酸的多肽。现在批准的药物多肽
里含D一aa的还不是很多,但是已经进入临床实验的数百个candidates里面含D多肽已经
占到百分之三十以上.在可以预见的将来,化学法仍然会是多肽工业生产的主流,另有个
别特殊多肽可以通过重组生产
【在 b******y 的大作中提到】
: Thanks for sharing the info. Clearly, academia is totally different from
: industry.
: Out of curiosity, what kind of and how many drugs are made of peptide?
|
|
|
e****e
发帖数: 1042 | 51 呵呵，我面试这个职位的时候，学到的最新知识就是水在这个生产过程中有多贵。比如
我们一般最开始拿到的yeast culture是60000升，如果某个流程里用多一倍的水，那就
是多少体积的水？盛这些水的容器要花多少钱？这些水一般是要处理后才能排出，那污
水处理是多少钱？转移这些水的工人的人工是多少钱？
以前在学校的时候，动则用20个柱体积去洗柱子，现在是能少用水就少用水。我做的是
小量的工业生产，但是老板每次都盯着说，这步不能多用什么，那步不能多用什么，总
之是越简洁，将来工业生产的成本越低。
【在 o****u 的大作中提到】
: 其实我个人对这个项目非常好奇。
: 楼主说工业生产成本压力很大，一些常规的实验室技术不能应用，这是正确的。但是如
: 果连多用点水都要考虑过多，对3k多肽生产这样超高附加值的精细化工就是夸张了。
: 话说回来，3k-8k多肽的工业化生产其实是现阶段最难的。
: 现在3k多肽的主流工业生产还是化学法。药品市场90%以上种类的3k多肽都是合成的。
: 细胞重组表达的掰着手指都能数出来。前面我已经说了现在化学合成的3k多肽市场售
: 价是传统化药的数百倍乃至数千倍，大概在100欧元/克的水平。而一个能盈利的工业项
: 目，生产成本一般是不能超过终产品售价的30%的，因为还有运营，人员，税费，运输
: 和储藏等各种开支。多肽的工业化生产中，大约70%的成本是在粗产品的提纯，来达到
: 药用级别。也就是说，重组技术生产的粗提肽必须控制在10欧/克左右的水平。因此成
|
n********k
发帖数: 2818 | 52 见识了，你们工业界，也抽空都来普及普及！，这个系列的帖子，俺学习了！
【在 e****e 的大作中提到】
: 呵呵，我面试这个职位的时候，学到的最新知识就是水在这个生产过程中有多贵。比如
: 我们一般最开始拿到的yeast culture是60000升，如果某个流程里用多一倍的水，那就
: 是多少体积的水？盛这些水的容器要花多少钱？这些水一般是要处理后才能排出，那污
: 水处理是多少钱？转移这些水的工人的人工是多少钱？
: 以前在学校的时候，动则用20个柱体积去洗柱子，现在是能少用水就少用水。我做的是
: 小量的工业生产，但是老板每次都盯着说，这步不能多用什么，那步不能多用什么，总
: 之是越简洁，将来工业生产的成本越低。
|
o****u
发帖数: 214 | 53 hehe,impressive.
我知道的一般都是10方到15方的。40方的都很少。你们上来就是60方的发酵。你们到底
在做什么啊？按这个量预估，年产量是数百公斤级的吧。现在年需求量超过100kg的多
肽也没几个啊？
发酵工艺里面，用水大头是车间用水。像你说的这点工艺用水，其实不是很大的成本。
当然这和生产的东西有关。你要做生物燃料这样的bulky chemical，水费可能需要认真
计算。但是对多肽这样超昂贵的药物化工，工艺用水绝对占不到成本的大头。你自己也
可以简单计算一下。60方发酵，至少应该是百万欧元的产值了。你那几十方的水，多点
少点，能占到里面多少的比例。当然，我不是说可以像实验室一样，想用多少用多少的。
在工业管理的人，对每个环节自然都要叮嘱要不能浪费的。不然最后成本肯定没法控制
。但从全局考虑，控制重组多肽生产成本还是要从源头的表达量和下游的精加工入手。
你们
能在菌体中做到工业级的3k多肽过表达，再加上如果你们的工艺最后能够不过制备级
HPLC就通过FDA的话，实际就非常有竞争力了。
【在 e****e 的大作中提到】
: 呵呵，我面试这个职位的时候，学到的最新知识就是水在这个生产过程中有多贵。比如
: 我们一般最开始拿到的yeast culture是60000升，如果某个流程里用多一倍的水，那就
: 是多少体积的水？盛这些水的容器要花多少钱？这些水一般是要处理后才能排出，那污
: 水处理是多少钱？转移这些水的工人的人工是多少钱？
: 以前在学校的时候，动则用20个柱体积去洗柱子，现在是能少用水就少用水。我做的是
: 小量的工业生产，但是老板每次都盯着说，这步不能多用什么，那步不能多用什么，总
: 之是越简洁，将来工业生产的成本越低。
|
l**********1
发帖数: 5204 | 54 楼下和接近的楼下下的都 跑 zero floor 的主题了 |
l**********1
发帖数: 5204 | 55 利用人工智能免疫系 likes CD44 plus Hyaluronan (hyaluronic acid, HA) is a
linear naturally occurring polysaccharide 钓3kDa左右的多肽的鱼
可以不通过分离而直接挑出peptide or protein来特异反应--just matrix two cents.
References:
1)
Erickson M, Stern R.
Chain gangs: new aspects of hyaluronan metabolism.
Biochem Res Int.2012:893947.
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22216413
and
2)
Chaim OM et al.(2011)
Brown Spider (Loxosceles genus) Venom Toxins: Tools for Biological Purposes.
Toxins (Basel). 3: 309-344
Abstract
Venomous animals use their venoms as tools for defense or predation. These
venoms are complex mixtures, mainly enriched of proteic toxins or peptides
with several, and different, biological activities. In general, spider venom
is rich in biologically active molecules that are useful in experimental
protocols for pharmacology, biochemistry, cell biology and immunology, as
well as putative tools for biotechnology and industries. Spider venoms have
recently garnered much attention from several research groups worldwide.
Brown spider (Loxosceles genus) venom is enriched in low molecular mass
proteins (5-40 kDa). Although their venom is produced in minute volumes (a
few microliters), and contain only tens of micrograms of protein, the use of
techniques based on molecular biology and proteomic analysis has afforded
rational projects in the area and permitted the discovery and identification
of a great number of novel toxins. The brown spider phospholipase-D family
is undoubtedly the most investigated and characterized, although other
important toxins, such as low molecular mass insecticidal peptides,
metalloproteases and hyaluronidases have also been identified and featured
in literature. The molecular pathways of the action of these toxins have
been reported and brought new insights in the field of biotechnology. Herein
, we shall see how recent reports describing discoveries in the area of
brown spider venom have expanded biotechnological uses of molecules
identified in these venoms, with special emphasis on the construction of a
cDNA library for venom glands, transcriptome analysis, proteomic projects,
recombinant expression of different proteic toxins, and finally structural
descriptions based on crystallography of toxins.
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22069711
3)
Vaaje-Kolstad G et al. (2010)
An oxidative enzyme boosting the enzymatic conversion of recalcitrant
polysaccharides.
Science. 330: 219-222.
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20929773
more please refer one mentor Robert Stern of UCSF for Hyaluronan (hyaluronic
acid, HA) and CD44
his publications summary:
//www.researchgate.net/researcher/39036610_Robert_Stern
or other labs relative to this topic:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?db=pubmed&cmd=link&linkname=pubmed_pubmed_
citedin&uid=12385018
-----
[ 33 ]
发信人: sunnyday (飞鱼), 信区: Biology
标 题: Re: 什么protein assay可以区分protein和peptide？
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jun 20 10:48:23 2012, 美东)
我明白你的意思了。
你本来就是想看看有什么最新的特别fancy 的技术可以不通过分离而直接
挑出peptide or protein来特异反应啊。
那还真的没有这种技术。
因为蛋白本来就和peptide 没有啥严格区别。
is
【在 e****e 的大作中提到】
: No. I came from biochemistry labs. So can I get an conclusion that there is
: no a method can detect only the amount of protein but peptide? Of course I
: have a method to detect the amount of the peptide product.
|
o****u
发帖数: 214 | 56 你这个工业上真短期用不上。
其实楼主的问题很好解决。无非就是要在超滤前后看杂质去了多少。很常规的方法就能
知道。不过既然他也不打算问了，我也就不打算说了。
cents.
【在 l**********1 的大作中提到】
: 利用人工智能免疫系 likes CD44 plus Hyaluronan (hyaluronic acid, HA) is a
: linear naturally occurring polysaccharide 钓3kDa左右的多肽的鱼
: 可以不通过分离而直接挑出peptide or protein来特异反应--just matrix two cents.
: References:
: 1)
: Erickson M, Stern R.
: Chain gangs: new aspects of hyaluronan metabolism.
: Biochem Res Int.2012:893947.
: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22216413
: and
|
