z*t
发帖数: 863 | 1 目前在用real-time PCR扩一段基因组上GC rich region,设计了几条引物扩增不同的区
域，普通PCR跑胶没有见到可见的smear或者dimer。用ABI的SYBR green master mix
dissociation curve能见到多个peak，amplication curve也很奇怪。跑胶可以看到
smear和dimer...最简单的方法是换引物。。。但是俺要扩的区域CG含量很高。。。换
了primer估计还会有类似问题。。。
对付high CG常用的DMSO/Betaine啥的，在real-time PCR中有没有类似应用？
求做过high gc real-time PCR的大侠指点迷津啊 |
k****l
发帖数: 279 | 2 You should go ahead and try different primers
GC content is not a problem if you amplify 100bp
No DMSO needed |
z*t
发帖数: 863 | 3 how about primer dimer? I can see the main band, but since it's high GC, the
primer dimer and unspefic product really anoy me
【在 k****l 的大作中提到】
: You should go ahead and try different primers
: GC content is not a problem if you amplify 100bp
: No DMSO needed
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Z******5
发帖数: 435 | 4 只有多试几条引物了。
但我做的和你不一样，我设计的引物用普通Taq或者即使是专门扩高GC的kit也有很多非
特异性的，但是用Real Time的kit就非常好。 顺便说一下我用的是Brilliant
Brilliant® II SYBR® Green QPCR Master Mix (Stratagene)
另外引物拿到后就不要用普通的试来试去了，没啥意义，直接找几种做Real Time的kit
上就行了。 |
j****x
发帖数: 1704 | 5 非特异扩增可有时可以通过提高退火温度来消除，或者使用probe来提高qPCR的特异性
，另外，你可能还需要片段化一下你的模板genimic DNA，
如果你的非特异条带的溶解曲线和实际产物差别较大的话，在有些机器上可以直接排除
在读取范围之外从而消除对定量的影响 |
