e***o
发帖数: 344 | 1 想在一个细胞里同时表达GFP, RFP，BFP，不知道用什么办法能让这几个蛋白成像时各
自分得比较开，没有overlapping，（就像做DNA FISH那样），
不用很大的放大倍数就可以把几个蛋白分开.
不知道用弱启动子，或是加特殊的信号肽，比如锚定到细胞膜上或囊泡上什么的。
谢谢各位！ |
w*e
发帖数: 740 | 2 表达在细胞不同的部位，如
细胞核膜，细胞膜，其他细胞结构（如线粒体）不就可以了
有很多序列可以实现这些目的
【在 e***o 的大作中提到】
: 想在一个细胞里同时表达GFP, RFP，BFP，不知道用什么办法能让这几个蛋白成像时各
: 自分得比较开，没有overlapping，（就像做DNA FISH那样），
: 不用很大的放大倍数就可以把几个蛋白分开.
: 不知道用弱启动子，或是加特殊的信号肽，比如锚定到细胞膜上或囊泡上什么的。
: 谢谢各位！
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e***o
发帖数: 344 | 3 谢谢回复。我这几个FP需要用同样的信号肽。或者都不用。我想弱启动子，膜会不会好
一些。 |
e***o
发帖数: 344 | 4 有个问题，若弱动子的话，gfp可能也看不清楚，background 太高。好像不好弄啊。 |
b*********e
发帖数: 870 | 5 没太看懂。。。。
你是想用一个同样的信号肽带着不同的FPs，同时表达在一个细胞里？那他们三个都会
去同一个地方吧？比如你用CAAX，就会到膜上。
那你担心什么样的overlapping 问题？你这个表达的要求，他们三个的信号难道不是永
远在一起么？ |
w*e
发帖数: 740 | 6 我也没看懂lz的问题
不知道该怎么回了
【在 b*********e 的大作中提到】
: 没太看懂。。。。
: 你是想用一个同样的信号肽带着不同的FPs，同时表达在一个细胞里？那他们三个都会
: 去同一个地方吧？比如你用CAAX，就会到膜上。
: 那你担心什么样的overlapping 问题？你这个表达的要求，他们三个的信号难道不是永
: 远在一起么？
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w*e
发帖数: 740 | 7 同样的信号肽 ？
这样就表达在同一个地方了呀，不和你的愿望矛盾？
【在 e***o 的大作中提到】
: 谢谢回复。我这几个FP需要用同样的信号肽。或者都不用。我想弱启动子，膜会不会好
: 一些。
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e***o
发帖数: 344 | 8 不好意思，我没有表达得清楚。我的主要目的是表达这几个蛋白。让他们分的比较开，
彼此没有overlap（就像DNA FISH 那样，不同的颜色分得很开，各自独立）。不然就混
到一起了，只有一个颜色了。
我想过吧他们弄到细胞膜上，或囊泡上，什么的。不知道能不能通过confocal分开。
但是这几个construct要不不带信号肽，要不都得带一样的。因为我还得做得做别的实
验。 不知道我表达清楚了没有。
感谢！ |
l**********1
发帖数: 5204 | 9 LZ 换位思考下 如何?
即使五颜六色
用LSM510 Meta (Zeiss) 可以试下 分开各色 signal 吧
哪怕 z 轴上的 overlapping
Inverted LSM 510 laser scanning confocal microscope (Zeiss) - "Rocky"
META detector for spectral unmixing of fluorochromes with overlapping
spectra
http://www.rockefeller.edu/bioimaging/equipment
http://dbc.bio.uci.edu/pdf_documents/LSM510META_Zeiss.pdf
【在 e***o 的大作中提到】
: 不好意思，我没有表达得清楚。我的主要目的是表达这几个蛋白。让他们分的比较开，
: 彼此没有overlap（就像DNA FISH 那样，不同的颜色分得很开，各自独立）。不然就混
: 到一起了，只有一个颜色了。
: 我想过吧他们弄到细胞膜上，或囊泡上，什么的。不知道能不能通过confocal分开。
: 但是这几个construct要不不带信号肽，要不都得带一样的。因为我还得做得做别的实
: 验。 不知道我表达清楚了没有。
: 感谢！
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s******s
发帖数: 13035 | 10 混到一起怎么会是一个颜色？不同的激发和发散波长啊！
FP啥的最好不要弱表达，细胞快死的时候荧光背景还是很强的
【在 e***o 的大作中提到】
: 不好意思，我没有表达得清楚。我的主要目的是表达这几个蛋白。让他们分的比较开，
: 彼此没有overlap（就像DNA FISH 那样，不同的颜色分得很开，各自独立）。不然就混
: 到一起了，只有一个颜色了。
: 我想过吧他们弄到细胞膜上，或囊泡上，什么的。不知道能不能通过confocal分开。
: 但是这几个construct要不不带信号肽，要不都得带一样的。因为我还得做得做别的实
: 验。 不知道我表达清楚了没有。
: 感谢！
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b*********e
发帖数: 870 | 11 lz列的这仨FPs，假设是用的最常用的那几个，激发、发射光谱几乎完全不overlay，别
说用confocal了，就是普通的荧光显微镜都能分清楚的啊。尤其是在每个channel单独
照，emission filter足够好的情况下。
我觉得lz可能没有搞清楚这三个颜色是不同的channel，是分开来照的。。。。
【在 l**********1 的大作中提到】
: LZ 换位思考下 如何?
: 即使五颜六色
: 用LSM510 Meta (Zeiss) 可以试下 分开各色 signal 吧
: 哪怕 z 轴上的 overlapping
: Inverted LSM 510 laser scanning confocal microscope (Zeiss) - "Rocky"
: META detector for spectral unmixing of fluorochromes with overlapping
: spectra
: http://www.rockefeller.edu/bioimaging/equipment
: http://dbc.bio.uci.edu/pdf_documents/LSM510META_Zeiss.pdf
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n****k
发帖数: 516 | 12 cerulean/CFP vs YFP vs RFP 我们常拿来做三颜色共定位，多颜色比较某个的表达量
不能比其他的高太多。
【在 e***o 的大作中提到】
: 想在一个细胞里同时表达GFP, RFP，BFP，不知道用什么办法能让这几个蛋白成像时各
: 自分得比较开，没有overlapping，（就像做DNA FISH那样），
: 不用很大的放大倍数就可以把几个蛋白分开.
: 不知道用弱启动子，或是加特殊的信号肽，比如锚定到细胞膜上或囊泡上什么的。
: 谢谢各位！
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e***o
发帖数: 344 | 13 多谢各位的回复。应该是我没有表达清楚。这几种蛋白的ex/em肯定是可以分开的。我
的目的是想这几个蛋白分子在物理空间上分得比较开。这一点用靠分辨显微镜是比较容
易的，但在一般显微镜下，由于XFP表达都很多，就混在一起了，分子和分子之间分不
开。
最好就像做DNA FISH的染色，分得很开。 |
