d*****i
发帖数: 3905 | 1 用lentivirus deliver shRNA， infect后puromycin select 2到3周，先做RT-PCR，显
示最高knockdown efficiency有70%，细胞冻了后解冻做WB，显示protein几乎没啥变化
。Antibody可以detect FLAG-tagged的protein，所以觉得antibody似乎问题不大。
大家都啥建议？？Thx |
a*****n
发帖数: 2835 | 2 解冻以后的细胞再做一个RT-PCR看看
另外确认一下抗体能识别内源的蛋白
【在 d*****i 的大作中提到】
: 用lentivirus deliver shRNA， infect后puromycin select 2到3周，先做RT-PCR，显
: 示最高knockdown efficiency有70%，细胞冻了后解冻做WB，显示protein几乎没啥变化
: 。Antibody可以detect FLAG-tagged的protein，所以觉得antibody似乎问题不大。
: 大家都啥建议？？Thx
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s******y
发帖数: 28562 | 3 我听说有些公司的lentivirus vector 久了就会被inactivated
【在 d*****i 的大作中提到】
: 用lentivirus deliver shRNA， infect后puromycin select 2到3周，先做RT-PCR，显
: 示最高knockdown efficiency有70%，细胞冻了后解冻做WB，显示protein几乎没啥变化
: 。Antibody可以detect FLAG-tagged的protein，所以觉得antibody似乎问题不大。
: 大家都啥建议？？Thx
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d*****i
发帖数: 3905 | 4 怎么确认识别内源蛋白？？
【在 a*****n 的大作中提到】
: 解冻以后的细胞再做一个RT-PCR看看
: 另外确认一下抗体能识别内源的蛋白
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d*****i
发帖数: 3905 | 5 mRNA跟WB cell大概早了两个passag。被inactivate mRNA level不会回去？只在
protein level？
【在 s******y 的大作中提到】
: 我听说有些公司的lentivirus vector 久了就会被inactivated
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s******y
发帖数: 28562 | 6 我的意思是在你把细胞冷冻然后又解冻的过程中，那个lentiviral based shRNA 失效
不表达了。所以有可能在你检测WB的时候mRNA level 已经上升到原来的水平了。建议
你把同一批细胞拿来同时测mRNA and protein level.
【在 d*****i 的大作中提到】
: mRNA跟WB cell大概早了两个passag。被inactivate mRNA level不会回去？只在
: protein level？
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w*****r
发帖数: 2061 | 7 不都整合到genome了？
【在 s******y 的大作中提到】
: 我的意思是在你把细胞冷冻然后又解冻的过程中，那个lentiviral based shRNA 失效
: 不表达了。所以有可能在你检测WB的时候mRNA level 已经上升到原来的水平了。建议
: 你把同一批细胞拿来同时测mRNA and protein level.
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s******y
发帖数: 28562 | 8 lentiviral shRNA vector 的promoter是可以被silence 的
我建议你先用RT-PCR 重新检查一次，先确定不是这些原因再说。
【在 w*****r 的大作中提到】
: 不都整合到genome了？
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c*******7
发帖数: 314 | 9 ft，为啥要puro select两到三周阿？太长了，2天就可以。2-3周我整个试验都做完了
。建议重新做一次，用早期的细胞看knockdown，我一般select完了立刻做wb。我的细
胞一直keep在半量的puro里面，3个礼拜之后好几个shRNA的knockdown明显就减弱了，
从90%降到50%knockdown |
d*****i
发帖数: 3905 | 10 试过2天的，RT-PCR显示没两周的KD高。你是测得RT-PCR还是WB啊？
【在 c*******7 的大作中提到】
: ft，为啥要puro select两到三周阿？太长了，2天就可以。2-3周我整个试验都做完了
: 。建议重新做一次，用早期的细胞看knockdown，我一般select完了立刻做wb。我的细
: 胞一直keep在半量的puro里面，3个礼拜之后好几个shRNA的knockdown明显就减弱了，
: 从90%降到50%knockdown
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i*****g
发帖数: 11893 | 11 puro selection no guarantee stable knockdown
puro只要一点点 就可以保证细胞活下来
但是，表达一点点，未必能有足够量 miRNA shRNA production |
l**********1
发帖数: 5204 | |
Z******5
发帖数: 435 | 13 我们现在就碰到类似的问题了。过表达一个病毒膜蛋白，瞬转和刚刚建好的stable
cell，用qPCR和WB都能检测到。但是传过十几代后，qPCR检测还是表达非常高，而WB就
检测不到了。 |
q***7
发帖数: 144 | 14 你如果用的是Qiagen 或其他公司的柱子提的RNA，那你有没有考虑过RNA样品中的洗液
的影响？
尤其是RNA浓度低的样品。因为要调成和浓度高的样品一样的总量，所以要加的比较高
的体积。这样在反转录体系中这个低样品的洗液就多，抑制反转录酶的活性很强。所以
你虽然放了一样多的总RNA，但是大多都没有被反转录。当你所qPCR时，你这个样品的
Ct值会很高，意思就是表达很低。所以就是给你表达低的假现象。你做qPCR时，可以留
意一些低浓度样品的Ct值。很多人发表的qPCR的文章后来表明结果相反，有一些原因是
这些研究者没有考虑这个原因。
这是我给另外一个贴子的回复
Qiagen柱子提取的RNA总是含很多的洗液。后面会影响到反转录酶的活性。如果每个样
品的浓度不一样，你做qPCR时，要调成一样的浓度，这样你做反转录的每一个样品的反
应液里含有的洗液浓度就不一样。不一样的洗液浓度，抑制反转录酶的程度也不一样。
这样你最后出来的qPCR结果肯定不准确。有的样品里表达低，可能是因为洗液多而抑制
了反转录酶造成的，而不是真正的表达低。如果你同一组的样品，有的表达高，有的表
达低，一般都是这个原因造成的. 建议你试一试这个公司的KIT，而且还可以同时检测
小RNA。便宜又好用
http://www.greenbioresearch.com/mitotal-rnamini-using-qiagen-ki |
s*****g
发帖数: 7857 | 15 我们实验室也有类似情况。开始还行，后来就不行了。
我也懒得查了，就还用电转了，死的多，就死吧，转完能筛选活下来的（需要一段时间
长起来）一般都还可以。就是费时间而已。最好的情况是一个细胞系转了，因为不好选
单细胞克隆（悬浮，死细胞太多），就混养了。这还养了两三年，一直knockdown90%。
但也有不好的细胞系knockdown40%。 |
I***a
发帖数: 13467 | |
d****i
发帖数: 2346 | |
q***7
发帖数: 144 | 18 好多人的Knockdown用qPCR检测时，其实检测到的低表达（高CT值）其实大部分都是由
于里面的洗液抑制了反转录而导致CDNA量少而造成的。尤其是KNOCKDOWN样品的低浓度
时，尤其是如此。可以试一下这个公司的RNA提取盒。可以同时提mRNA和小RNA。
http://www.greenbioresearch.com/mitotal-rnamini-using-qiagen-ki |
d****i
发帖数: 2346 | 19
读了Qi的那篇Cell文章，感觉CRISPRi还是跟转染效率有关，对于转染困难的细胞估计
还是不太好。位置也需要优化，Fig7里面7个只有2个稍微好点。
不过跟RNAi相比特异性很好！
【在 l**********1 的大作中提到】
: 都哪个年代了还shRNA
: why not try CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
: Repeats)
: http://www.addgene.org/crispr/qi/
: http://optforce.wordpress.com/2012/07/13/crispr-potential-knock
: http://www.mpi-marburg.mpg.de/randau/research.html
: more 考古下买卖提的旧帖
: http://www.mitbbs.com/mitbbs_article_t.php?board=Biology&gid=31
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l**********1
发帖数: 5204 | 20 mark.
【在 d****i 的大作中提到】
:
: 读了Qi的那篇Cell文章，感觉CRISPRi还是跟转染效率有关，对于转染困难的细胞估计
: 还是不太好。位置也需要优化，Fig7里面7个只有2个稍微好点。
: 不过跟RNAi相比特异性很好！
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a********a
发帖数: 428 | 21 嗯，本来想在老鼠上试试的，看了fig7后还是决定放弃了，
等着版本更新！
【在 d****i 的大作中提到】
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: 读了Qi的那篇Cell文章，感觉CRISPRi还是跟转染效率有关，对于转染困难的细胞估计
: 还是不太好。位置也需要优化，Fig7里面7个只有2个稍微好点。
: 不过跟RNAi相比特异性很好！
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d****i
发帖数: 2346 | 22
也不是不可行，跟RNAi刚出来一样，都需要优化，一开始有点被神化了。
【在 a********a 的大作中提到】
: 嗯，本来想在老鼠上试试的，看了fig7后还是决定放弃了，
: 等着版本更新！
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m*****z
发帖数: 1451 | 23 转染效率matters a lot
【在 d****i 的大作中提到】
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: 也不是不可行，跟RNAi刚出来一样，都需要优化，一开始有点被神化了。
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g*********5
发帖数: 2533 | |
S*********s
发帖数: 304 | 25 CRISPRi真核细胞还是不行的
真核细胞DNA有高级结构
还是knockout
【在 d****i 的大作中提到】
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: 也不是不可行，跟RNAi刚出来一样，都需要优化，一开始有点被神化了。
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