T****u
发帖数: 424 | 1 http://blog.sina.com.cn/s/blog_12d8810790102uyry.html
有微友私信问设计siRNA、shRNA和gRNA. 今天先说siRNA和shRNA吧。
一般我是take advantage of sigma. 他们有现成的shRNA产品，而且反响很好。
当然了，土豪可以自己去Dharmacon订购siRNA， 或者在sigma订购shRNA,甚至是包装好
的病毒。
1.第一步去sigma英文网站，一定要是英文网站
http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html
#华夏小奇说实验的事#设计siRNA和shRNA
2. 搜索你感兴趣的基因。如TNFR, 出来结果之后点击shRNA(下图黑色剪头所示)
插播广告 订购基因敲除小鼠请访问公司网站（2-4个月，小鼠转基因、敲除敲入、条件
性敲除）
#华夏小奇说实验的事#设计siRNA和shRNA
3. 点击进入下个页面，点击pricing，会出现每个shRNA的hairpin的序列。
如下面的序列，介于“CCGG”和"CTCGAG"之间的，就是shRNA的目... 阅读全帖 |
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g****y
发帖数: 101 | 2 大家好,
我有一个课题是通过抑制一个oncogene的功能来治疗这个基因突变（Gain of function
）引起的癌症（T cell leukemia），之前通过molecular docking从NCI 筛选小分子化
合物来抑制蛋白与蛋白的相互作用，做的不是很理想。
最近想通过SiRNA或者ShRNA抑制这个基因的表达，最终目的是为了能在体内有效的特异
地抑制肿瘤细胞里这个oncogene的表达，从而可以选择性的杀死肿瘤细胞。对这个领域
不是很熟悉，读了一些文献之后上来寻求大家的帮助，
预见的可能问题及解决方法：
1：SiRNA 或者ShRNA的特异性：
SiRNA 或者ShRNA可能会非特异的抑制其它基因的表达，可以通过仔细选择SiRNA 或者
ShRNA的序列(避免同源序列)来降低非特异抑制，请问大家还有什么办法来提高特异性
吗？
2：体外合成的SiRNA在体内容易被降解：
通过对SiRNA进行一定的修饰可以提高稳定性，但是我觉得通过病毒介导表达ShRNA 可
能是一个更好的办法，因为这个是由基因突变（Gain of function）产生的疾病，体外
合成的SiRNA不能... 阅读全帖 |
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m****M
发帖数: 360 | 3 谁有shRNA Screening的经验，给参谋一下。
涉及到的问题
１。同一个老鼠基因的SHRNA是否在所有组织的细胞中KNOCKDOWN效率都是一样的？
２。什么病毒的侵染效率最高？Lentivirus还是Adenovirus?
本人想screen一个老鼠基因的shRNA，从５个shRNA中找到knockdown效率最高的一个shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病毒去侵染我最后的细胞系。为了偷懒，不想把５个shRNA都做成病毒，请问此方法是否可行？有没有这样做的大狭？
谢谢。 |
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m****M
发帖数: 360 | 4 谁有shRNA Screening的经验，给参谋一下。
涉及到的问题
１。同一个老鼠基因的SHRNA是否在所有组织的细胞中KNOCKDOWN效率都是一样的？
２。什么病毒的侵染效率最高？Lentivirus还是Adenovirus?
本人想screen一个老鼠基因的shRNA，从５个shRNA中找到knockdown效率最高的一个shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病毒去侵染我最后的细胞系。为了偷懒，不想把５个shRNA都做成病毒，请问此方法是否可行？有没有这样做的大狭？
谢谢。 |
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m******m
发帖数: 535 | 5 刚刚接触细胞生物学，没做过knockdown，这里问两个关于mammalian细胞knockdown的
初级问题，请大家不要笑话。
1） 准备在raw cell line 中 knockdown一个kinase，初步看看对下游cytokine的表达
有没有影响，看文献有人用Dharmacon的siRNA pool转化，有人用lentivirus shRNA，
请问哪种方法更简单？
2） 如果直接转化siRNA，等3－4天以后，细胞都分裂了好几代了，是不是每隔细胞内
的siRNA的量减少很多，这样是不是knockdown的效果就不好了？
3） 为什么siRNA可以直接转化knockdown基因表达，但是好像很少人直接转化shRNA去
knockdown的？为什么shRNA都要科隆在plasmid载体或者virus载体内呢？直接转化难道
不能被dicer酶加工变成siRNA吗？（因为从文献上查到了一个shRNA的序列，如果能直
接合成然后象siRNA那样转化，岂不是能剩了买siRNA的钱，又剩去了科隆shRNA到载体
的时间）。
比较初级的问题，请别笑话！
谢谢！ |
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b**********8
发帖数: 349 | 6 还可以考虑Clontech的pSingle-tts-shrna system。不过感觉这些系统做做体外应该还
行，上到体内实验的话不知道效果如何，目前用inducible shRNA 做体内的文献还不多。
另外，有没有用pSingle-tts-shrna system朋友推荐个好点的control shRNA sequence
，我试了好几对公开的control shRNA sequence，可以克隆到这个载体里面后，添加
Doxycycline后对我的目的基因都有干扰作用，而且还能达到40%的效果，头痛得很，后
面要开始建稳定细胞系，可是control还没有搞定。 |
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C*****h
发帖数: 926 | 7 可以的。
最好把你的基因序列，克隆到一个Luciferase的质粒里，你的序列紧跟在Luciferase的
stop codon之后，但是在poly(A) signal site之前。
然后，把你的shRNAs和这个重组的Luciferase质粒，同时转染到human HEK293T细胞中
（最容易转染的细胞）。48小时后，测Luciferase活力。
我一般，都是同时检测至少10个shRNAs（每一个基因，无论是人的，还是老鼠的基因），
两天之内就知道哪个shRNA效率最高。
shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转
化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病
毒去侵染我最后的细胞系。为 |
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C*****h
发帖数: 926 | 8 可以的。
最好把你的基因序列，克隆到一个Luciferase的质粒里，你的序列紧跟在Luciferase的
stop codon之后，但是在poly(A) signal site之前。
然后，把你的shRNAs和这个重组的Luciferase质粒，同时转染到human HEK293T细胞中
（最容易转染的细胞）。48小时后，测Luciferase活力。
我一般，都是同时检测至少10个shRNAs（每一个基因，无论是人的，还是老鼠的基因），
两天之内就知道哪个shRNA效率最高。
shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转
化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病
毒去侵染我最后的细胞系。为 |
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B******o
发帖数: 496 | 9 这个library是based on pLKO hairpin shRNA。 这种shRNA比较高效。
OpenBiosystem还有另一种miR based shRNA pooled library。不过俺试过的～20
shRNA
clones knockdown效率都很差。但是这个library已经被好几个lab用过了(Gregary
Hannon, Michael Green等).你可以权衡一下,呵呵
Good luck
readout. |
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d*p
发帖数: 534 | 10 I am using Broad library. There are 3 major problems for all the available
libraries.
1st, huge shRNA variation in pool, which means you are going to lose some
shRNAs due to low signal.
2nd, readout, both microarray and deep sequencing are available, however, if
you can not avoid PCR on the hairpin, you will always have difficulty in
the secondary structure.
3rd, even 5 shRNAs per gene, you will still find a large number of genes
without effective shRNA.
If you only need to find some interesting... 阅读全帖 |
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Z**********g
发帖数: 222 | 11 1. 没有直接合成shRNA转染的吧.shRNA比siRNA长,又还需要dicer处理,又不能解决长时
间效力的问题,吃饱了撑着合成shRNA啊.
2. 所以shRNA都是转化成DNA的形式,然后克隆到载体上.用载体直接转染后,若不筛选稳
定克隆则仍然无法解决长时间效力的问题.当然病毒好一些. |
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b**********8
发帖数: 349 | 12 因为最近要用Plenti lox3.7这个载体设计shRNA,找了一些paper作参考，无意中看到这
篇paper，里面给出的shRNA序列如下
sh1, upper strand: TGNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTCAAGAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNCTTTTTTC;
N代表反向互补的shRNA序列。问题是第二个碱基G，按照U6启动子的要求这样做没错，
但是必须也在poly T序列之前加一个互补的C碱基吗？
附上另一个shRNA表达载体的说明书，似乎不用在poly TZ之前再加多一个互补的C碱基
。到底是否必须加一个互补的C呢？请大家给点经验。
谢谢 |
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s******y
发帖数: 28562 | 13 谢谢大家给了那么多的好建议！我一开始就想动手去改那个pGIPZ 里面的MCS site
的。其实即使不用改，在那个XhoI - EcoRI 旁边就有一个BamHI。所以我非常疑惑那个
公司为什么放着这么简单的方法不用而非要那么麻烦的在不同的质粒之间倒腾。但是听
起来貌似是他们的shRNA 很就以前就做在pSM2里面了所以就将错就错的啊。
不过上面一个好心的网友和另外一个发私信给我的网友都告诉了我要小心这个CMV
promoter, 这么一听我就有点介意了。因为虽然我主要用的是immortalized 细胞系,但
是偶尔也会整整一些primary cells, blood cells 之类的。如果CMV 有这个问题的话
我就不想在上面投入太多精力了。
我在addgene 上找另外两个网友说的荧光标记的shRNA vector 的时候，非常碰巧的看
到了这个 pLKO.3G, 上面的说明是 pLKO.1-puro 改成的。不知道有没有人用过？ http://www.addgene.org/14748/
如果这个好用的话我可能就用这个了。因为我的好几个其他shRNA construct 都... 阅读全帖 |
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j********r
发帖数: 156 | 14 那个TRC弄出的也称为一代shRNA (by Broad Institue). Hannon, Elledge作的是二代
，as 楼上mentioned, it is based on a natural miRNA structure. Both libraries
have been used extensively to generate lots of high-profile papers。
Generation II的library出的文章似乎要多一些，光 Elledge就好多篇 (such as
Synthetic lethality with RAS, cancer essential genes, tumor suppressor REST
and PTPN12, etc).
顺便问一下，shRNA导致的any phenotype是不是很难去rescue by introducing back
shRNA-resistant gene. 昨天还在看science那两篇cancer essential genes的文章，
似乎都没对任何hit试图rescue。那位大虾解... 阅读全帖 |
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n******2
发帖数: 971 | 15 I have the exact same question as LZ asked. Why can't we just use shRNA to
do transient transfection to knock down a gene? Once the shRNA constructs
get into cells, small hairpin RNA will be transcripted, which will be
further chopped by Dicer into siRNA. Thereafter, shRNA shares the same
mechanism for knocking down certain gene as siRNA does. What's the reason
to make stable transgenic cell line? |
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d*******s
发帖数: 61 | 16 我只用过siRNA，目前做了一个shRNA载体，但还没有使用。直接转染shRNA质粒应该是
可行的。目前有很多载体，表达shRNA而且带有真核筛选抗性。虽然效率比病毒低，但
是只要你筛选一下，应该就能解决这个问题！ |
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g****y
发帖数: 101 | 17 谢谢评论, 我也觉得ShRNA的特异性是一个很大的问题, 不过目前有一些文献说可以
optimized siRNA design来提高或者解决特异性的问题(当然这些文章可能就是wdgca所
说的灌水文章,赫赫).
考虑到很多药物都有off-target effect, 或者说目前的治疗手段(如化疗)会有大的副
作用, 对于癌症病人来说, 很多时候是存活时间长短的问题, 如果一种手段能把存活期
由一年延伸到5-10年的话,这种手段还是有一定价值的.
回到我的project, 如果我optimized shRNA design, 并且把ShRNA 连到 T Cell
specific promoter 后面, 那就可以把off-target effect限制在T细胞(大部分都是
leukemia)里面, 这样是不是可以提高这个实验设计的可行性呢? |
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f******g
发帖数: 1003 | 18 因为open biosystem最开始使用的是pSM2质粒，设计好的shRNA全部克隆到这个载体里
面，后来有了慢病毒lentiviral vector（pGIpz），他们就把原来的psm2的shRNA全部
克隆到新的pgipz上面，另外还有新设计的shRNA。
突变掉另外那个EcorI没有任何影响，我们已经做了。
还有，如果你想转干细胞，至少是造血干，pGIPz不是一个很好的选择，因为他的启动
子是CMV，转干细胞效率极低。如果是普通的细胞系，应该没有问题。原代细胞，我没
有试过。
如果你实在没有好的选择，短信我，我有修饰过的pGIPz载体，很好用。但是要和老板
签署MTA。
cassette |
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L****T
发帖数: 169 | 19 1，把shRNA质粒送去测一下序列（国内公司一般测不出来不收钱），很可能在你把质粒
带回国重新转化抽质粒过程搞混了。
2，另外，你puromycin杀了几天？有些shRNA筛选时间长了虽然细胞还耐受puromycin但
U6会被silence。
3，自己重新再做几个shRNA呗，国内引物合成便宜。 |
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h******y
发帖数: 351 | 20 请问大家在设计shRNA的时候，target靶序列的antisense应该放在loop的哪边？前面？
后面？还是
无所谓？
对于shRNA转变成siRNA，请问下面所示的两种情况，哪种（loop在双链的左边或者在双
链的右边）形
式更容易与Dicer结合，从而被切割成siRNA？
/￣\
5'-sense-----strand－ | loop
3'-antisense-strand－\_/
/￣\
loop | -sense-----strand－3'
\_/-antisense-strand－5'
我看到很多人把antisense放在loop的后面，很多文献上也是这样示意的，但是
Genscript的人告诉
我放在哪边都无所谓。请问是这样吗？
多谢。 |
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s********l
发帖数: 58 | 21 请教一下大家，我们一直用psuper的shrna系统，它的target是基因上的19mer的序列，沉默某基因
的效果不错，现在想用另外一个系统来沉默这个基因，这个系统target基因上的21mer的序列，能否把19mer添加两个碱基？
怎么添加成功几率比较大？ |
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j********r
发帖数: 156 | 22 Thanks. So if I get very quick phenotypes in cultured cells using siRNA
transfection, will the data be convincing? Do I still need stable shRNA (
regular of conditionally if it is lethal) to confirm the results?
It seems there are also disadvantages of shRNA, such as in some cases
sequence-specific toxicity (probably due to overloading the RNAi machineary)
. But I am not sure about the down side of using siRNA. |
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d******u
发帖数: 178 | 23 shRNA library的话，好像就Sigma和Thermo/OpenBiosystems两家有。这两家不过是
Broad和CSH这两个source的distributor，主要就是pLKO和pGIPZ两种骨架的shRNA.两种
我都用过，因为每个基因一般会order3-5个hairpin，基本上里面至少有一个的
knockdown是不错的。 |
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s*********y
发帖数: 387 | 24 biomacro, thanks for the infor.
I will not consider openbiosystem, as heard many complains about its
efficacy.
can you explain more about this
"这个library是based on pLKO hairpin shRNA。 这种shRNA比较高效"
I also worry about that for one cell, it may be infected by more than
one type of virus, making the downstream identification of specific ones
tricky?
do you think the flow based assay will be sufficient?
thanks. |
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s*********y
发帖数: 387 | 25 thanks, try to follow your post.
"rescue by introducing back
I would say this is very difficult, unless you focus on several of
interests hits and redesign the shRNA targeting UTRs...
One another question, have you tried to work on Generation one shRNAs?
libraries
REST |
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B******o
发帖数: 496 | 26 pLKO shRNA是那种很传统的小RNA加个环，属于人工做的hairpin。但KD效果不错，俺买
来的或者自己做的，总有几个有很高的KD效率。总之成功率比较高，用着放心。
你如果担心一个细胞多个virus感染，可以把MOI控制好。Sigma给你的virus应该是已经
测好titer的，你计算一下尽量用低MOI，比如MOI=1. 这样的话细胞基本都只有一个
virus。
Flow是比较高效的方法，如果你确信有比较好的marker可以收集你要的细胞。收集好了
以后送deep seq就知道有哪些shRNA在里面了。
不过deep seq你需要好的data processing的人，noise很多，得想办法滤掉 |
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q*****n
发帖数: 1035 | 27 有效的shRNA的sense序列可以直接用来合成siRNA么？
很多有效的shRNA/siRNA序列并不是AA（AG）开始的，有影响么?
谢谢 |
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o**4
发帖数: 35028 | 29 siRNA是瞬时转染，只能维持几天，对于一般细胞来说，比shRNA lentivirus简单好用。
shRNA lentivirus主要是为了稳定转染，建立knockdown的细胞系，需要构建质粒、做
病毒，然后infection，麻烦些。 |
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C*****h
发帖数: 926 | 30 1. ShRNA needs time (24-48 hours) to get maximum expression, while siRNA
can function immediately after transfection.
2. For a lot of cell lines, transfection efficiency of shRNA-plasmids
(large size) is low, while that of siRNAs is high because of the small size.
to |
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m*********7
发帖数: 5207 | 31 For question #3: the purpose of cloning shRNA into lentiviral vector is to
produce virus particles, and in principle, every single target cell can be
infected. If you use shRNA plasmid directly, you can hardly get 100%
transfection efficiency. |
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Z**********g
发帖数: 222 | 32 你这个直接合成然后转染是什么意思吧.
是直接合成shRNA(非DNA)?这会比siRNA便宜吗,会比siRNA效率高吗,能延长时效吗?都不
能吧.
是直接合成shRNA的DNA?它能被转录吗,有干扰效率吗,能延长时效吗?都不能吧.
siRNA |
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B******o
发帖数: 496 | 33 pLKO.1本身就是lentiviral vector. 你用它在293细胞内生产lentivirus。然后用
virus直接infect你的目标细胞。感染后，vector大概需要2-3天开始表达你的shRNA，
你再等个2-3天就可以看knockdown的效率了。生产virus的时候你需要co-transfect
virus packaging vector。 SBI的那套效率不错。Addgene上也有类似的，具体的条件
得自己摸一下。
pLKO如果只是做transfection的时候KD效率不咋的。但用virus去KD基因的话，5个
shRNA至少有2个都能超过70%。
infect过的细胞因为virus是整合在基因组上的，可以养很长时间，即使不加药筛
选。 |
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L*****o
发帖数: 48 | 34 sorry to referring this topic to ask a shRNA related question. When doing
shRNA transfection (lentiviral vector), do you need to starve the cells
using conditional medium? |
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l**********1
发帖数: 5204 | 35 //biowulf.bu.edu/zlab/PromoSer/
>哺乳系统， 哪个网站去找一个基因的promoter的？
----
设计shRNA hairpins 序列的？
//codex.cshl.org/RNAi_central/RNAi.cgi?type=shRNA
//codex.cshl.org/research.php
all hints from
2008 SUNY one PhD dissertation
full text pdf link:
//dspace.sunyconnect.suny.edu/bitstream/handle/1951/47599/000000431.sbu.pdf?sequence=3 |
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w*****r
发帖数: 2061 | 36 有些paper里说3个mismatch就可以做control shRNA，有些要rescue也只有5个左右
degenerate mismatches就行。当然一般都做了western blot来确认，但感觉上有点少。
想请教一下，从经验上说一般shRNA target sequence (20-30nt length?)出现多少个
nt mismatch会影响knock down效率？另外，这些mismatch是tandem还是separate关系大吗？ |
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E*****s
发帖数: 39 | 37 我最近在做shRNA转染，用puromycin筛选到一些稳定的细胞的克隆，qPCR检测到大约有
50～60％的silencing effect，但是western检测不到蛋白水平降低，请问会是什么原
因呢？
我用cycloheximide查蛋白的half－life，48小时候也没什么变化。难道是因为蛋白太
稳定了，所以shRNA的silencing effect在蛋白水平检测不到？另外我的蛋白检测抗体
是兔单抗，超级灵敏，难道是太灵敏了，细微的差别在曝光后显不出来？
新人求解，愚蠢的问题还请原谅。。。 |
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a****d
发帖数: 1919 | 38 FUGW-H1 lentiviral vector for shRNA. It has ubiquitin promoter for EGFP and
H1 promoter for shRNA expression.
You can find it on Addgene.
到。 |
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S*********s
发帖数: 304 | 39 你得有足够量的细胞来做screen
现在的shRNA library有20K gene, 每个基因3-5 shRNA
每个基因30-100 copy
60K X 30 = 180K
能用cell line的话还是用cell line比较好吧~ |
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d*p
发帖数: 534 | 40 Yes, I am working on T cell.
Broad library: 5-10 shRNA per gene.
It is necessary to collect at least >200 copies per shRNA.
You may use focused pool. The trick is how to get high infection rate. |
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c******r
发帖数: 3778 | 41
//会
//是
//是
drug selection gene 需不需要加，
//一般drug selection 比较方便长期保持shRNA表达。
如
//可以。但是如果长期培养，会导致逐步失去shRNA的表达，也失去GFP表达。
//depends，自己测试就知道了。
的。
//看barcode怎么设计的。一般应该是的。 |
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y*****a
发帖数: 6 | 42 求教大神！
我现在有针对靶基因的确认有效的shRNA两条，一条是19bp（原来用在pSUPER上的），
另一条是21bp（原来用在pLKO.1上的），能相互转换？
还有这两条好用的shRNA可以直接作为合成siRNA的序列使用吗？
网上众说纷纭，求教Knockdown大神！ |
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w******e
发帖数: 1187 | 43 bryan cullen has a paper on designing shRNA |
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y****m
发帖数: 37 | 44 design your shRNA look like pre-miR-451,
I guarantee your knockdown effect unless your target is not accessible |
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c*********u
发帖数: 3128 | 45 如题，因为我们做的是大鼠，找不到靶基因的cDNA，自己钓基因的话非常麻烦，经常出
现突变。
想请教各位达人，筛选shDNA candidates时，需要靶基因的cDNA，这个cDNA公司能给做
吗？哪个公司shRNA设计的服务比较好？价钱公道？
请推荐，先谢谢大家了！ |
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h*****o
发帖数: 342 | 46 我用过Dharmacon的，不错
你可以在他们网上搜一下你的基因，也许已经有现成的shRNA |
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o**4
发帖数: 35028 | 47 我用了3个不同位点的shRNA，去做knockdown，
然后用2对不同的引物去检测靶向表达，
得到的结果都是剧烈上调。
怎么解释啊？
O(∩_∩)O谢谢 |
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o*****a
发帖数: 2335 | 48 也许是把那个作用酶饱和了，结果endogenous microRNA发挥不了正常作用，靶基因就
上调了。好像RNAi和microRNA都有这种可能，shRNA不知道。 |
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a********k
发帖数: 2273 | 49 sorry,没有做过lenti， 不熟悉有哪些vector可以用。有没有哪个lentiviral vector
可以同时表达两个不同的shRNA，并且有荧光marker做FACS啊？ |
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s******r
发帖数: 2876 | 50 天然的miRNA也有很多同时表达的吧，
你可以模拟他那个结构，用pTRIPZ来表达。
sorry,没有做过lenti， 不熟悉有哪些vector可以用。有没有哪个lentiviral vector
可以同时表达两个不同的shRNA，并且有荧光marker做FACS啊？ |
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