i*********0
发帖数: 915 | 1 最近有发现一个现象。mESCs，用一个gene 的shRNA 处理以后，通过RNA-seq， 发现整
个X 染色体上的gene 都被silence了 （程度不一，但是都在shRNA treated ESCs
samples，都有2-8倍数的reduction）。 这种现象说明了什么？
有没有做X染色体transcription牛牛来说说看？ |
t******k
发帖数: 5617 | |
l*******i
发帖数: 153 | 3 有意思。
是female mESC吗？是的话，先做两个实验：
1）H3K27me3 immunostaing：可能发现small dot in nucleus.
2)qRT-PCR测Xist的表达，或者用FISH。
证实的话，就说明出现X chormosome inactivation了。
几个问题：
3) mESC的培养条件？serum,还是2i/LIF?
1）knockdown的mESC是否仍保持未分化状态，还是开始分化了？如果未分化，那么很有
可能你发现了一个新的调节X reactivation/inactivation的因子，做深了，至少是
cell stem cell.如果细胞分化了，那么X chromosome上的genes表达下调不奇怪，有多
大新意取决于你的这个gene
2）看一下这个基因的功能，是否已有先关报道，与X chromosome reactivation有关。
是histone modifier, TF还是在X chromsome上的新lncRNA? |
i*********0
发帖数: 915 | 4 我明天确认一下是不是female 的ESCs。
对于其他的问题：
几个问题：
3) mESC的培养条件？serum,还是2i/LIF?
serum + LIF的培养条件
1）knockdown的mESC是否仍保持未分化状态，还是开始分化了？如果未分化，那么很有
可能你发现了一个新的调节X reactivation/inactivation的因子，做深了，至少是
cell stem cell.如果细胞分化了，那么X chromosome上的genes表达下调不奇怪，有多
大新意取决于你的这个gene
如果要看Oct4等gene的表达的话，RNA 水平上看到降低，Protein水平上有20%左右的降
低。但是这些pluripotency的gene在蛋白水平还维持在一个高的状态。
2）看一下这个基因的功能，是否已有先关报道，与X chromosome reactivation有关。
是histone modifier, TF还是在X chromsome上的新lncRNA?
该gene目前的功能还不清楚。另外，我看到Xist gene在shRNA处理想样品中，在RNA水
平上有3倍数的降低。
【在 l*******i 的大作中提到】
: 有意思。
: 是female mESC吗？是的话，先做两个实验：
: 1）H3K27me3 immunostaing：可能发现small dot in nucleus.
: 2)qRT-PCR测Xist的表达，或者用FISH。
: 证实的话，就说明出现X chormosome inactivation了。
: 几个问题：
: 3) mESC的培养条件？serum,还是2i/LIF?
: 1）knockdown的mESC是否仍保持未分化状态，还是开始分化了？如果未分化，那么很有
: 可能你发现了一个新的调节X reactivation/inactivation的因子，做深了，至少是
: cell stem cell.如果细胞分化了，那么X chromosome上的genes表达下调不奇怪，有多
|
l*******i
发帖数: 153 | 5 Xist下调是RNA-seq的结果，还是qPCR结果？这一点比较奇怪，与X chromosome
inactivation不一致。
按理说，在mESC中，X chromosome是active的，即XaXa，Xist应该不表达才对。Xist表
达时，会把其中一条X chromosome“包裹”起来，这条chromosome进而失活。X
inactivation一般指发生在female mEpiSC与分化的细胞中.
你这个结果与理论相反，X chromosome基因下调时，Xist竟然也降低。Xist在对照和
knockdown细胞中的表达分别是多少(RPKM or CT value)？
另一个问题，由于你用的培养条件是serum+LIF,这会导致heterogeneity.建议你用2i/
LIF.
knockdown mESC分化明显吗？ colony morphology改变如何，还是依旧维持与WT一样的
形态？
如果你确定用的是female mESCs的话，建议先做H3K27me3 staining,看看X chromosome
是不是失活的。
【在 i*********0 的大作中提到】
: 我明天确认一下是不是female 的ESCs。
: 对于其他的问题：
: 几个问题：
: 3) mESC的培养条件？serum,还是2i/LIF?
: serum + LIF的培养条件
: 1）knockdown的mESC是否仍保持未分化状态，还是开始分化了？如果未分化，那么很有
: 可能你发现了一个新的调节X reactivation/inactivation的因子，做深了，至少是
: cell stem cell.如果细胞分化了，那么X chromosome上的genes表达下调不奇怪，有多
: 大新意取决于你的这个gene
: 如果要看Oct4等gene的表达的话，RNA 水平上看到降低，Protein水平上有20%左右的降
|
i*********0
发帖数: 915 | 6
是RNA-seq的结果。我也觉得很奇怪，
这一点比较奇怪，与X chromosome
Xist在对照和
这个我要去问一下我们的搞生物信息学的。
ok！
分化不明显。
colony morphology改变如何，还是依旧维持与WT一样的
colony looks like the control shRNA clone。 shiny and clear boundary
【在 l*******i 的大作中提到】
: Xist下调是RNA-seq的结果，还是qPCR结果？这一点比较奇怪，与X chromosome
: inactivation不一致。
: 按理说，在mESC中，X chromosome是active的，即XaXa，Xist应该不表达才对。Xist表
: 达时，会把其中一条X chromosome“包裹”起来，这条chromosome进而失活。X
: inactivation一般指发生在female mEpiSC与分化的细胞中.
: 你这个结果与理论相反，X chromosome基因下调时，Xist竟然也降低。Xist在对照和
: knockdown细胞中的表达分别是多少(RPKM or CT value)？
: 另一个问题，由于你用的培养条件是serum+LIF,这会导致heterogeneity.建议你用2i/
: LIF.
: knockdown mESC分化明显吗？ colony morphology改变如何，还是依旧维持与WT一样的
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o**i
发帖数: 1165 | 7 5 楼说得对.mESC XaXa的
我记得naive的mESC是 XaXa的到了primed阶段就变成了XaXi,自然X上的gene有差别.我
忘记这两者之间有哪个gene的变化了.但colony形态上会有差别.
我猜可能你哪个基因跟维持mESC 的naive状态相关. |
o**i
发帖数: 1165 | 8 我觉得肯定是female的啊,不用看了.
如果是male的细胞.人家本来就一个x 您还给knockdown了 还让不让细胞活了.细胞没Y
活的好好的,没X死翘翘啊. |
s******r
发帖数: 1245 | 9 你的RNAseq是strand specific的？
不是的话应该没法区分xist和tsix因为它俩有一部分互为antisense，需要做specific
region的qPCR来验证是哪个的变化，可能降低的是tsix那是会激活xi的
【在 i*********0 的大作中提到】
:
: 是RNA-seq的结果。我也觉得很奇怪，
: 这一点比较奇怪，与X chromosome
: Xist在对照和
: 这个我要去问一下我们的搞生物信息学的。
: ok！
: 分化不明显。
: colony morphology改变如何，还是依旧维持与WT一样的
: colony looks like the control shRNA clone。 shiny and clear boundary
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i*********0
发帖数: 915 | 10 谢谢大家的comment。我再读一下paper，好好的消化一下，再和大家讨论。 |
