S**y
发帖数: 283 | 1 我们用qPCR通过计算基因，来比较细菌的数目，
一个是野生型，一个是突变体；
有两对引物，一对是16s，一对是特异基因B的，
用16s引物，野生型和突变体比较没问题，结果都正常；
但是用基因B的引物，在突变体中比野生型高100000倍，
检查各种情况，多次重复，基因B引物总是在突变体中比野生型高100000倍。 |
S**y
发帖数: 283 | 2 如果是仪器问题，那应该16s引物也出问题；
如果是突变体基因b拷贝数重排增加，也拿不至于100000个拷贝数， |
x********e
发帖数: 35261 | 3 怎么可能。100000大概是16-17个cycle。你两个pcr的ct值能差那么多？
【在 S**y 的大作中提到】
: 我们用qPCR通过计算基因，来比较细菌的数目，
: 一个是野生型，一个是突变体；
: 有两对引物，一对是16s，一对是特异基因B的，
: 用16s引物，野生型和突变体比较没问题，结果都正常；
: 但是用基因B的引物，在突变体中比野生型高100000倍，
: 检查各种情况，多次重复，基因B引物总是在突变体中比野生型高100000倍。
|
S**y
发帖数: 283 | 4 对，cq值就是差这么多，
计算10^7的同样野生型和突变体的细菌数，pcr出来突变体是10^12个，
用16s引物就没有这个问题。
【在 x********e 的大作中提到】
: 怎么可能。100000大概是16-17个cycle。你两个pcr的ct值能差那么多？
|
S**y
发帖数: 283 | 5 现在找不到问题来自哪里？
产物跑胶，突变体是带亮一些，但是不至于上万倍。 |
l***y
发帖数: 638 | 6 基因B被mutate了吧，ct相差这么多就是PCR不work |
k****n
发帖数: 158 | 7 是做RT-qPCR 吗， 也许是RT的cDNA有问题， 换一个RT KIt 试试看。推荐
Thermofisher 的Superscript IV 它相对于其它的RT盒子优势是比较明显的：
sensitivity, robustness, representativity (低表达不会被弱化， 高表达不会被放
大）。
但是价格比较贵。 |
x********e
发帖数: 35261 | 8 难道你wt的ct接近30或者30以上？
【在 S**y 的大作中提到】
: 对，cq值就是差这么多，
: 计算10^7的同样野生型和突变体的细菌数，pcr出来突变体是10^12个，
: 用16s引物就没有这个问题。
|
x********e
发帖数: 35261 | 9 对，感觉是wt PCR是没有amplify
【在 l***y 的大作中提到】
: 基因B被mutate了吧，ct相差这么多就是PCR不work
|
F******p
发帖数: 2099 | |
