Z******5
发帖数: 435 | 1 大家做qRT-PCR的时候，一般是最后加模板还是最后加引物？
我觉得为了使定量准确，应该先加模板，然后分装，再分别加引物。
因为决定Ct值的是模板量，引物是过量的，先加模板分装后再加引物能够保证内参和目
的基因所使用的模板量差异达到最小。 |
h********n
发帖数: 4079 | 2 I think you are right.
I talked with tech experts in ABI and they suggested the primer should be
the last to dispense. |
c******r
发帖数: 3778 | 3 我觉得先加样容易cross contaminate啊？ |
Z******5
发帖数: 435 | 4 我之所以问这个问题，是看了一些kit的protocol，上面都是说最后加模板，所以比较
困惑。
【在 h********n 的大作中提到】
: I think you are right.
: I talked with tech experts in ABI and they suggested the primer should be
: the last to dispense.
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s******y
发帖数: 28562 | 5 做相对定量的话当然先加引物，否则的话，PCR的条件就很不一致了，产生的
曲线斜率也不一样（这个和过量已否无关）就很难在不同的模板之间比较了。
而且我不理解你这个先加模板的说法，因为我们一般都是比较不同模板的，
怎么可以先加模板呢？除非你是要做同一个模板里面不同基因的绝对定量，才有
这个选项。
【在 Z******5 的大作中提到】
: 大家做qRT-PCR的时候，一般是最后加模板还是最后加引物？
: 我觉得为了使定量准确，应该先加模板，然后分装，再分别加引物。
: 因为决定Ct值的是模板量，引物是过量的，先加模板分装后再加引物能够保证内参和目
: 的基因所使用的模板量差异达到最小。
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Z******5
发帖数: 435 | 6 比如说我要检测没有处理的细胞Con和处理后的细胞Tre之间基因G表达的变化，那么就
是要分别定量Con和Tre cDNA中基因G和内参GAPDH的量。 要看基因G的变化，就是看它
在实验组和对照组中相对于内参的变化。 这个应该算是同一个模板里不同基因的相对
定量吧。
【在 s******y 的大作中提到】
: 做相对定量的话当然先加引物，否则的话，PCR的条件就很不一致了，产生的
: 曲线斜率也不一样（这个和过量已否无关）就很难在不同的模板之间比较了。
: 而且我不理解你这个先加模板的说法，因为我们一般都是比较不同模板的，
: 怎么可以先加模板呢？除非你是要做同一个模板里面不同基因的绝对定量，才有
: 这个选项。
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s******y
发帖数: 28562 | 7 份特。你这个明显用一个很简单的相对定量qPCR就可以搞定。
应该就是不同的模板！因为处理和没有处理的细胞的模板是分开的！
绝对不可以混到一起来！否则就没法作了！
【在 Z******5 的大作中提到】
: 比如说我要检测没有处理的细胞Con和处理后的细胞Tre之间基因G表达的变化，那么就
: 是要分别定量Con和Tre cDNA中基因G和内参GAPDH的量。 要看基因G的变化，就是看它
: 在实验组和对照组中相对于内参的变化。 这个应该算是同一个模板里不同基因的相对
: 定量吧。
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Z******5
发帖数: 435 | 8 我也分特了，我的意思是比如定对照组中基因G和GAPDH的量时，应该先把模板，mix之
类的加到一起，最后分装之后再加引物。
【在 s******y 的大作中提到】
: 份特。你这个明显用一个很简单的相对定量qPCR就可以搞定。
: 应该就是不同的模板！因为处理和没有处理的细胞的模板是分开的！
: 绝对不可以混到一起来！否则就没法作了！
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Z******5
发帖数: 435 | 9 可能我表述的不完整，不清楚，还是重新说一次。
两个样品--实验组&对照组， 两对引物--目的基因和内参， 假设每个只做一管，不用
做重复，那么最后是4管反应体系。加样顺序有两种：
1，分别加一个2x的 实验组cDNA，qPCR MIX, Dye，H2O 和 对照组cDNA，qPCR MIX，
Dye，H2O， 然后再分别分装成两管，最后分别加引物。
2，分别加一个2x的 目的基因引物，qPCR MIX, Dye，H2O 和 内参引物，qPCR MIX，
Dye，H2O， 然后再分别分装成两管，最后分别加cDNA。
我觉得1更合理，但是很多kit的protocol上是最后才加cDNA。 |
h********n
发帖数: 4079 | 10 I mean in 3-replicate wells, the last thing is addition of primer.
【在 s******y 的大作中提到】
: 做相对定量的话当然先加引物，否则的话，PCR的条件就很不一致了，产生的
: 曲线斜率也不一样（这个和过量已否无关）就很难在不同的模板之间比较了。
: 而且我不理解你这个先加模板的说法，因为我们一般都是比较不同模板的，
: 怎么可以先加模板呢？除非你是要做同一个模板里面不同基因的绝对定量，才有
: 这个选项。
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y***k
发帖数: 60 | 11 理论上确实1更好一点，可以减少不同管中cDNA量差异带来的误差
不过碰到大量sample的情况还是2更方便啊......并且我不觉得2会比1差很多......
，
，
【在 Z******5 的大作中提到】
: 可能我表述的不完整，不清楚，还是重新说一次。
: 两个样品--实验组&对照组， 两对引物--目的基因和内参， 假设每个只做一管，不用
: 做重复，那么最后是4管反应体系。加样顺序有两种：
: 1，分别加一个2x的 实验组cDNA，qPCR MIX, Dye，H2O 和 对照组cDNA，qPCR MIX，
: Dye，H2O， 然后再分别分装成两管，最后分别加引物。
: 2，分别加一个2x的 目的基因引物，qPCR MIX, Dye，H2O 和 内参引物，qPCR MIX，
: Dye，H2O， 然后再分别分装成两管，最后分别加cDNA。
: 我觉得1更合理，但是很多kit的protocol上是最后才加cDNA。
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C*******e
发帖数: 4348 | 12 有人可以更加明确的告诉我假设加样非常准确的话
最后加引物和最后加模板两个到底有什么不一样么？ |
Z**********g
发帖数: 222 | 13 都非常准确了,还有差别?可能就是省不省事的差别,比如样品多,扩的基因少,就先加引
物;样品少,扩的基因多,就先加模板,这样就比较省事.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 有人可以更加明确的告诉我假设加样非常准确的话
: 最后加引物和最后加模板两个到底有什么不一样么？
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c******r
发帖数: 3778 | 14 同学，你这个连term都乱用啊
模板是说template，就是你的cDNA。
你的例子中必须按2做，1有systematic error，你看不出来？
你的目的是比较Con和Tre的中以GAPDH做reference时候G的区别。所以是比较模板的区
别。
因此你需要把没差别的东西都一同混合，减少因为这些东西差别引起的系统误差。这里
面包括：MasterMix，Dye，水，所有primers等等，就是除了你的cDNA之外的所有东西
。然后分装到PCR plate上。然后把cDNA直接加到你的plate上，这样你的每一个well直
接的差别就是你的cDNA的差别，不是primer的差别。
另外，其实，你可以做one-step RT-PCR，定量更准确。 |
C*******e
发帖数: 4348 | 15 我就是这个意思啊
所以lz的意思没看懂
想让人指点一下
【在 Z**********g 的大作中提到】
: 都非常准确了,还有差别?可能就是省不省事的差别,比如样品多,扩的基因少,就先加引
: 物;样品少,扩的基因多,就先加模板,这样就比较省事.
|
C*******e
发帖数: 4348 | 16 还是院长一针见血
【在 c******r 的大作中提到】
: 同学，你这个连term都乱用啊
: 模板是说template，就是你的cDNA。
: 你的例子中必须按2做，1有systematic error，你看不出来？
: 你的目的是比较Con和Tre的中以GAPDH做reference时候G的区别。所以是比较模板的区
: 别。
: 因此你需要把没差别的东西都一同混合，减少因为这些东西差别引起的系统误差。这里
: 面包括：MasterMix，Dye，水，所有primers等等，就是除了你的cDNA之外的所有东西
: 。然后分装到PCR plate上。然后把cDNA直接加到你的plate上，这样你的每一个well直
: 接的差别就是你的cDNA的差别，不是primer的差别。
: 另外，其实，你可以做one-step RT-PCR，定量更准确。
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s******y
发帖数: 28562 | 17 这个实验不是这么做的。因为大部分情况下面，不同的primer 所用的
PCR condition 不一样，所以不推荐在同一个cycle 里运行。
你应该是个菜鸟吧？那就不要乱改protocol 了。
这个实验应该这么做：
1. Primer gene G premixed, then add template control and template treated separately, with 3 replica .
2. Primer GAPDH premixed, then add template control and template treated separately, with 3 replica
所以要跑两次PCR.
【在 Z******5 的大作中提到】
: 我也分特了，我的意思是比如定对照组中基因G和GAPDH的量时，应该先把模板，mix之
: 类的加到一起，最后分装之后再加引物。
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s******y
发帖数: 28562 | 18 可是他明显不是那个意思啊，他是想把template 先加上去，然后再加不同的
primer. 所以他这个不是为了做3-replicate
【在 h********n 的大作中提到】
: I mean in 3-replicate wells, the last thing is addition of primer.
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c******r
发帖数: 3778 | 19 应该可以做multiplex reaction
GAPDH是可以做所谓的internal control的。就是说，在同一个pcr中，同时run两个甚
至两个targets，其中一个是control，另外一个是要测的基因。
这个internal control的目的有两个，一个是quality control，就是保证这个
reaction没有忘掉任何东西，没有加错任何东西等等。另外一个目的是loading
control，assumption就是两个sample中的GAPDH是不变的，换句话说，要测量的是在同
样量的GAPDH下，要测的基因在处理前和处理后有无变化。
为了达到这个目的，最好是run multiplex。这样才能保证测到的GAPDH和G之间是来自
确定的同一个loading量。
另外一个run multiplex的原因是统计的原因。如果分开run GAPDH和G，那么
triplicate之后会得到三个G的量，和三个GAPDH的量，而这六个量之间没有一一对应的
关系。就是说不能用G1/GAPDH1，G2/GAPDH2。。。。而只能用G的平均值/GAPDH的平均
值。但是得到的这个平均值却没有standard deviation。因为G的值是符合正态分布的
，GAPDH的三个值也符合正态分布。但是两个值相除之后却不是正态分布。因此不存在
standard deviation。如果做图，那么只有一个bar，却没有分布范围，不知道其可信
区间在哪里。
因此，qPCR，一般都是run multiplex的reaction的。
而调整PCR condition是相对简单的事情，比如适当设计primers就可以了。
separately, with 3 replica .
separately, with 3 replica
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个实验不是这么做的。因为大部分情况下面，不同的primer 所用的
: PCR condition 不一样，所以不推荐在同一个cycle 里运行。
: 你应该是个菜鸟吧？那就不要乱改protocol 了。
: 这个实验应该这么做：
: 1. Primer gene G premixed, then add template control and template treated separately, with 3 replica .
: 2. Primer GAPDH premixed, then add template control and template treated separately, with 3 replica
: 所以要跑两次PCR.
|
Z**********g
发帖数: 222 | 20 sun姐可能误解了LZ的意思了，LZ是说对于同一模板（比如control的cDNA）,假设要扩3
个基因，又假设每个基因3个replica，就是9管，这样先配9倍体积的1X mix,包括
Mastermix,dye,H2O,cDNA,然后分装成9管，每三管分别加入1个基因的primer；同样对
treated的cDNA也一样。
然后有人说这样就产生了由引物带来的系统误差。我的问题是如果最后加入模板，由
pipeting所产生的误差叫什么误差？如果由引物带来的系统误差都足够大到不能忽略的
话，那么可以想象，由最后一步加入模板所产生的这种误差会大到何等程度。这样反而
最后加引物更为准确了。
不过如果最后加引物，对于同一模板同一扩增基因的replica而言，似乎就没什么意思
了，感觉这种replica目的是要测由所加引物所带来的差别。
【在 s******y 的大作中提到】
: 可是他明显不是那个意思啊，他是想把template 先加上去，然后再加不同的
: primer. 所以他这个不是为了做3-replicate
|
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f*********r
发帖数: 1233 | 21 大家都过虑了。
模板（样品、cDNA）加得一致不一致，其实没那么重要。精益求精当然好，但RT-PCR是
个非常敏感的实验，duplicates或triplicates之间Ct值互相吻合的程度很低（相对于
其他定量试验而言，比如ELISA）。一般情况下，duplicates的Ct值相差0.5就可以容忍
（有的实验室可能要求0.2，我在此致用0.5来举例）。那么这个0.5是个什么概念呢？
那就是2^0.5，或者说根号2，也就是1.4。这两个duplicates，其中一个比另一个高40%
，这样都可以容忍。
你加模板的时候，假设加5ul。140%就相当于7ul。你想想看，谁加样的技术能差到这个
地步？所以说，模板加得是不是一致，并不重要。Ct值的偏差来自于其他试验条件。
那么引物啊、buffer啊、原料啊（dNTP）、酶啊等等的重要程度如何呢？我不想展开太
多。简便起见，我只说说引物和master mix（就是buffer，原料、酶、荧光染料的混合
物）。在对数扩增曲线（LOG VIEW）中，模板的多少主要影响x轴截距；引物的多少主
要影响平台的高度；master mix的特性主要影响斜率（线性区）。与模板对曲线的影响
强弱相仿，如果不彻底改变反应体系，仅仅是先加哪个先混合哪个，最终对扩增曲线的
影响是微乎其微的。如果大家实验室有富余盘子和药品，不妨自己做做各种反应物的浓
度曲线，看看这些因素到底能带来多大影响。
RT-PCR的系统误差远远高于随机误差，包括误差出现的频度与误差对最终结果的影响。
以下方面会带来比较明显的系统误差：
机器有没有校正
盘子能不能盖严
膜或者盖子是不是每个孔都很干净
盘子well壁是不是光滑，cycle过程中，会不会有水汽凝结在壁上，而不流回well底部
盘子与机器是否绝对吻合，盘子是不是能真正放平 |
C*******e
发帖数: 4348 | 22 对于院长的这句话我不敢苟同
“只能用G的平均值/GAPDH的平均值。但是得到的这个平均值却没有standard
deviation”
如果照你这么说的
那还需要误差传递公式做什么
【在 c******r 的大作中提到】
: 应该可以做multiplex reaction
: GAPDH是可以做所谓的internal control的。就是说，在同一个pcr中，同时run两个甚
: 至两个targets，其中一个是control，另外一个是要测的基因。
: 这个internal control的目的有两个，一个是quality control，就是保证这个
: reaction没有忘掉任何东西，没有加错任何东西等等。另外一个目的是loading
: control，assumption就是两个sample中的GAPDH是不变的，换句话说，要测量的是在同
: 样量的GAPDH下，要测的基因在处理前和处理后有无变化。
: 为了达到这个目的，最好是run multiplex。这样才能保证测到的GAPDH和G之间是来自
: 确定的同一个loading量。
: 另外一个run multiplex的原因是统计的原因。如果分开run GAPDH和G，那么
|
C*******e
发帖数: 4348 | 23 “realtime PCR是个非常敏感的实验”
我非常同意这一点
换句话说，这个实验有很大的系统误差
说实话，是属于你做得越多想得越多越不喜欢不觉得可信的一种实验！
40%
【在 f*********r 的大作中提到】
: 大家都过虑了。
: 模板（样品、cDNA）加得一致不一致，其实没那么重要。精益求精当然好，但RT-PCR是
: 个非常敏感的实验，duplicates或triplicates之间Ct值互相吻合的程度很低（相对于
: 其他定量试验而言，比如ELISA）。一般情况下，duplicates的Ct值相差0.5就可以容忍
: （有的实验室可能要求0.2，我在此致用0.5来举例）。那么这个0.5是个什么概念呢？
: 那就是2^0.5，或者说根号2，也就是1.4。这两个duplicates，其中一个比另一个高40%
: ，这样都可以容忍。
: 你加模板的时候，假设加5ul。140%就相当于7ul。你想想看，谁加样的技术能差到这个
: 地步？所以说，模板加得是不是一致，并不重要。Ct值的偏差来自于其他试验条件。
: 那么引物啊、buffer啊、原料啊（dNTP）、酶啊等等的重要程度如何呢？我不想展开太
|
Z******5
发帖数: 435 | 24 假设两次加模板的量分别是X1和X2，得到的Ct值分别是Ct1和Ct2，
那么delta Ct= log（X1/X2，2）
假设加模板的误差是1%，简单点，就是你一管加了5ul，另一管加了4.95ul， 那么
delta Ct就是0.0145， 这个误差肯定是可以接受的；
但是假设加模板的误差是1/10，就是你一管加了5ul，另一管加了4.5ul，那么delta Ct
就是0.152，这个误差还是不算小，但也还算可以接受。
我想即使对于菜鸟而言，加模板的误差也不应该比1/10再大了，所以我还是收回我的问
题算了，不过很感谢各位的讨论。
我还是菜鸟，自己勤快一点，早算一算就好了。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 有人可以更加明确的告诉我假设加样非常准确的话
: 最后加引物和最后加模板两个到底有什么不一样么？
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Z******5
发帖数: 435 | 25 同意你这个说法，哈哈。 我就是要检测对照组和实验组中10几个基因的差别，所以就
先加模板了。
【在 Z**********g 的大作中提到】
: 都非常准确了,还有差别?可能就是省不省事的差别,比如样品多,扩的基因少,就先加引
: 物;样品少,扩的基因多,就先加模板,这样就比较省事.
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Z******5
发帖数: 435 | 26 菜鸟弱弱的问一下，one-step RT-PCR指的就是Two-Step Cycling？
【在 c******r 的大作中提到】
: 同学，你这个连term都乱用啊
: 模板是说template，就是你的cDNA。
: 你的例子中必须按2做，1有systematic error，你看不出来？
: 你的目的是比较Con和Tre的中以GAPDH做reference时候G的区别。所以是比较模板的区
: 别。
: 因此你需要把没差别的东西都一同混合，减少因为这些东西差别引起的系统误差。这里
: 面包括：MasterMix，Dye，水，所有primers等等，就是除了你的cDNA之外的所有东西
: 。然后分装到PCR plate上。然后把cDNA直接加到你的plate上，这样你的每一个well直
: 接的差别就是你的cDNA的差别，不是primer的差别。
: 另外，其实，你可以做one-step RT-PCR，定量更准确。
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Z******5
发帖数: 435 | 27 我设计引物的时候都会设计成同一个退火温度的。一次PCR搞定，这样比较方便呢。
separately, with 3 replica .
separately, with 3 replica
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个实验不是这么做的。因为大部分情况下面，不同的primer 所用的
: PCR condition 不一样，所以不推荐在同一个cycle 里运行。
: 你应该是个菜鸟吧？那就不要乱改protocol 了。
: 这个实验应该这么做：
: 1. Primer gene G premixed, then add template control and template treated separately, with 3 replica .
: 2. Primer GAPDH premixed, then add template control and template treated separately, with 3 replica
: 所以要跑两次PCR.
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Z******5
发帖数: 435 | 28 "在同一个pcr中，同时run两个甚至两个targets，其中一个是control，另外一个是要
测的基因"
这个用TaqMan貌似是可以，但是我们一般只用SYBR GREEN，一管中不能同时跑两个反应
的。
【在 c******r 的大作中提到】
: 应该可以做multiplex reaction
: GAPDH是可以做所谓的internal control的。就是说，在同一个pcr中，同时run两个甚
: 至两个targets，其中一个是control，另外一个是要测的基因。
: 这个internal control的目的有两个，一个是quality control，就是保证这个
: reaction没有忘掉任何东西，没有加错任何东西等等。另外一个目的是loading
: control，assumption就是两个sample中的GAPDH是不变的，换句话说，要测量的是在同
: 样量的GAPDH下，要测的基因在处理前和处理后有无变化。
: 为了达到这个目的，最好是run multiplex。这样才能保证测到的GAPDH和G之间是来自
: 确定的同一个loading量。
: 另外一个run multiplex的原因是统计的原因。如果分开run GAPDH和G，那么
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f*********r
发帖数: 1233 | 29 讨论总是有益的。自己算，即使能得出准确数值，但是得不出集体讨论所覆盖的广泛外
延。
做RT-PCR，不用过分追求百分之几、十几、甚至几十的误差。因为cDNA存在百分之几百
、几千的差别（也就是数量级上有差别），才会有蛋白水平上detectable的差别，才会
有意义。
Ct
【在 Z******5 的大作中提到】
: 假设两次加模板的量分别是X1和X2，得到的Ct值分别是Ct1和Ct2，
: 那么delta Ct= log（X1/X2，2）
: 假设加模板的误差是1%，简单点，就是你一管加了5ul，另一管加了4.95ul， 那么
: delta Ct就是0.0145， 这个误差肯定是可以接受的；
: 但是假设加模板的误差是1/10，就是你一管加了5ul，另一管加了4.5ul，那么delta Ct
: 就是0.152，这个误差还是不算小，但也还算可以接受。
: 我想即使对于菜鸟而言，加模板的误差也不应该比1/10再大了，所以我还是收回我的问
: 题算了，不过很感谢各位的讨论。
: 我还是菜鸟，自己勤快一点，早算一算就好了。
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c******r
发帖数: 3778 | 30 是吗？给科普一下吧
【在 C*******e 的大作中提到】
: 对于院长的这句话我不敢苟同
: “只能用G的平均值/GAPDH的平均值。但是得到的这个平均值却没有standard
: deviation”
: 如果照你这么说的
: 那还需要误差传递公式做什么
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c******r
发帖数: 3778 | 31 sybr啊，那就没办法了
【在 Z******5 的大作中提到】
: "在同一个pcr中，同时run两个甚至两个targets，其中一个是control，另外一个是要
: 测的基因"
: 这个用TaqMan貌似是可以，但是我们一般只用SYBR GREEN，一管中不能同时跑两个反应
: 的。
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h********n
发帖数: 4079 | 32 在 triplicate里面加1 ul cDNA, 加样误差影响比较大. 如果加1 ul primer, 误差其
实没啥影响.
40%
【在 f*********r 的大作中提到】
: 大家都过虑了。
: 模板（样品、cDNA）加得一致不一致，其实没那么重要。精益求精当然好，但RT-PCR是
: 个非常敏感的实验，duplicates或triplicates之间Ct值互相吻合的程度很低（相对于
: 其他定量试验而言，比如ELISA）。一般情况下，duplicates的Ct值相差0.5就可以容忍
: （有的实验室可能要求0.2，我在此致用0.5来举例）。那么这个0.5是个什么概念呢？
: 那就是2^0.5，或者说根号2，也就是1.4。这两个duplicates，其中一个比另一个高40%
: ，这样都可以容忍。
: 你加模板的时候，假设加5ul。140%就相当于7ul。你想想看，谁加样的技术能差到这个
: 地步？所以说，模板加得是不是一致，并不重要。Ct值的偏差来自于其他试验条件。
: 那么引物啊、buffer啊、原料啊（dNTP）、酶啊等等的重要程度如何呢？我不想展开太
|
j****x
发帖数: 1704 | 33 无论如何不建议使用1ul这样小的模板量，误差太大，我这里用机器人上样误差都有20-
30%，我猜想手工加之会更多吧
一般20ul的PCR体系，模板我使用4ul/以上（cDNA的话可以稀释），如果是sybr的话我
甚至用8ul，基本上模板造成的误差在10%以内了，再有triplicates基本上就消除影响了
【在 h********n 的大作中提到】
: 在 triplicate里面加1 ul cDNA, 加样误差影响比较大. 如果加1 ul primer, 误差其
: 实没啥影响.
:
: 40%
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s******y
发帖数: 28562 | 34 顶一下这个。 我一般都至少用3ul
20-
响了
【在 j****x 的大作中提到】
: 无论如何不建议使用1ul这样小的模板量，误差太大，我这里用机器人上样误差都有20-
: 30%，我猜想手工加之会更多吧
: 一般20ul的PCR体系，模板我使用4ul/以上（cDNA的话可以稀释），如果是sybr的话我
: 甚至用8ul，基本上模板造成的误差在10%以内了，再有triplicates基本上就消除影响了
|
f*********r
发帖数: 1233 | 35 cDNA的量直接影响x轴截距，也就是Ct值。当然影响大了。引物只影响平台的高低，跟
Ct值没有直接关系。当然就是没啥影响了。
1ul，不要说试验人员的加样技术不行，就连枪都不一定过关。唉！厂家建议的50ul，
被鸡贼的PI改成25ul，后来不断改成15，甚至10。做人不能太贪心。
【在 h********n 的大作中提到】
: 在 triplicate里面加1 ul cDNA, 加样误差影响比较大. 如果加1 ul primer, 误差其
: 实没啥影响.
:
: 40%
|
Z******5
发帖数: 435 | 36 听说那个384 well的就是用10ul的反应体系啊。 我只用过96 well的，一般都是20ul体
系。
【在 f*********r 的大作中提到】
: cDNA的量直接影响x轴截距，也就是Ct值。当然影响大了。引物只影响平台的高低，跟
: Ct值没有直接关系。当然就是没啥影响了。
: 1ul，不要说试验人员的加样技术不行，就连枪都不一定过关。唉！厂家建议的50ul，
: 被鸡贼的PI改成25ul，后来不断改成15，甚至10。做人不能太贪心。
|
M****m
发帖数: 2142 | 37 我是引物相同的都先混在同一个1.5 ml管子里，其实也就是俩管子，一个是
housekeeping gene another one is the target gene，然后按模板在分出来，一般
technical control，就是同一个模板3个重复，96 well也就是32个小管，16 each for
the two genes，然后模板加3 ul，但是一般是做4份的量，因为分装第三个总会不够
，所以要多作出来一份。我是10 ul体系，所以就是做40 ul （36 ul master mix+4 ul
template），还有这样你模板不会只加1 ul，相对而言加的量更精确些。不知道说明
白没有。。。【 在 Zifeng85 (Zifeng85) 的大作中提到: 】 |
M****m
发帖数: 2142 | 38 误差总是存在的，只要最后error bar不是很离谱我觉得都可以接受啊。
另外排枪觉得很不好用，有的时候有几个不能完全加进去，不过确实比一个一个加速度
快很多
扩3
【在 Z**********g 的大作中提到】
: sun姐可能误解了LZ的意思了，LZ是说对于同一模板（比如control的cDNA）,假设要扩3
: 个基因，又假设每个基因3个replica，就是9管，这样先配9倍体积的1X mix,包括
: Mastermix,dye,H2O,cDNA,然后分装成9管，每三管分别加入1个基因的primer；同样对
: treated的cDNA也一样。
: 然后有人说这样就产生了由引物带来的系统误差。我的问题是如果最后加入模板，由
: pipeting所产生的误差叫什么误差？如果由引物带来的系统误差都足够大到不能忽略的
: 话，那么可以想象，由最后一步加入模板所产生的这种误差会大到何等程度。这样反而
: 最后加引物更为准确了。
: 不过如果最后加引物，对于同一模板同一扩增基因的replica而言，似乎就没什么意思
: 了，感觉这种replica目的是要测由所加引物所带来的差别。
|
M****m
发帖数: 2142 | 39 他应该不是指同一管而是同一plate，96的话就是各48，不过我们这里一个老板说还要
做3个no template的，所以其实是各45
【在 Z******5 的大作中提到】
: "在同一个pcr中，同时run两个甚至两个targets，其中一个是control，另外一个是要
: 测的基因"
: 这个用TaqMan貌似是可以，但是我们一般只用SYBR GREEN，一管中不能同时跑两个反应
: 的。
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M****m
发帖数: 2142 | 40 我一直作的10，结果也挺不错的啊，为什么说鸡贼？什么叫贪心，产出一样投入少挺好
的，实验室有钱无所谓钱不多就得较劲脑汁省钱。难道你是这些公司的？那么仇视。。
。。
【在 f*********r 的大作中提到】
: cDNA的量直接影响x轴截距，也就是Ct值。当然影响大了。引物只影响平台的高低，跟
: Ct值没有直接关系。当然就是没啥影响了。
: 1ul，不要说试验人员的加样技术不行，就连枪都不一定过关。唉！厂家建议的50ul，
: 被鸡贼的PI改成25ul，后来不断改成15，甚至10。做人不能太贪心。
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j****x
发帖数: 1704 | 41 LC480系统上一直用20，后来新来的博后建议改成10，测试了一下效果也还能接受，就是
SD明显大了不少，尤其是实验员负责加样的结果，经常惨不忍睹。后来换成了机器人情况
就好多了。对自己的枪和手比较有信心的话，10ul体系确实没什么问题
【在 M****m 的大作中提到】
: 我一直作的10，结果也挺不错的啊，为什么说鸡贼？什么叫贪心，产出一样投入少挺好
: 的，实验室有钱无所谓钱不多就得较劲脑汁省钱。难道你是这些公司的？那么仇视。。
: 。。
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M****m
发帖数: 2142 | 42 赞有钱，还有机器人。。。SE我的还不错，可能如果差别不是特别明显的SE大了会影响
，但是差别大应该没什么问题吧
就是
情况
【在 j****x 的大作中提到】
: LC480系统上一直用20，后来新来的博后建议改成10，测试了一下效果也还能接受，就是
: SD明显大了不少，尤其是实验员负责加样的结果，经常惨不忍睹。后来换成了机器人情况
: 就好多了。对自己的枪和手比较有信心的话，10ul体系确实没什么问题
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