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Biology版 - 请教realtime的问题
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做realtime PCR前,RNA要测浓度调正浓度吗?汗了个去,我的引物出啥问题了
反转录起始的rna量不相同,可以比较内参做qpcr分析吗?GAPDH的Ct值在30以上,这结果还可靠不?
用什么引物能够直接从RNA里把一个基因给扩出来?请问以cDNA为模板扩增8kb的一个基因是什么难度?
qPCR amplication curve- does anyone see this before?RACE求助!!
问一个比较白痴的问题,关于stop codon的引入请教一个未知引物序列的技术问题
请教3‘ RACE, 做了N 久没有目的条带,崩溃了。。问一个简单的引物分装的问题
奇怪的RT-PCR问题,只能扩增出短片段大家都用什么软件设计primer?
求助反转录PCR为什么one step RTPCR 一般都是用gene specific primer 而不是random oligomers
相关话题的讨论汇总
话题: realtime话题: rna话题: 问题话题: cdna
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d**********t
发帖数: 20415
1
最近realtime PCR遇到怪事了,请大家帮忙分析下原因:
问题:几个基因的值出现很多undetermined的结果,但是之前一直在同一个cell line
里做,一直都可以检测到
条件:Realtime的template是RNA反转录的cDNA
cell line和RNA抽提的方法都和以前一样,处理方法也一致
引物用的是刚刚从stock里面稀释出来的,和之前的实验来自同一管stock
拿之前证明可以检测到的RNA作为阳性对照,也是undetermined
反转录kit整个实验室公用,其他人没有遇到问题
反转录试过oligo dT和random primer,结果没有差别
其中一个基因刚刚设计了一对新引物结果也是undetermined
作为positive control的基因可以检测到没有问题
多谢了
如果需要更多细节,我会补充
A******y
发帖数: 2041
2
How many cycle did you run? What do your C(t) curves look like?
d****u
发帖数: 1553
3
你这个positive control和你的样品是相同的cDNA不同的基因呢,还是不同的cDNA相同
的基因。如果是前者,可能你的引
物有问题,如果是后者,那你得cDNA可能有问题

line

【在 d**********t 的大作中提到】
: 最近realtime PCR遇到怪事了,请大家帮忙分析下原因:
: 问题:几个基因的值出现很多undetermined的结果,但是之前一直在同一个cell line
: 里做,一直都可以检测到
: 条件:Realtime的template是RNA反转录的cDNA
: cell line和RNA抽提的方法都和以前一样,处理方法也一致
: 引物用的是刚刚从stock里面稀释出来的,和之前的实验来自同一管stock
: 拿之前证明可以检测到的RNA作为阳性对照,也是undetermined
: 反转录kit整个实验室公用,其他人没有遇到问题
: 反转录试过oligo dT和random primer,结果没有差别
: 其中一个基因刚刚设计了一对新引物结果也是undetermined

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为什么one step RTPCR 一般都是用gene specific primer 而不是random oligomers问一个比较白痴的问题,关于stop codon的引入
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