i********y
发帖数: 23 | 1 大家好，
问一个和我上个帖子类似的一个问题。我在网上看到有些公司说，可以在RNA反转录
cDNA的时候，不用oligoDT或者hexamer, 而直接用gene-specific primer把一个基因给
扩出来。据他们说这个效率是最高的。我想问一下，如果用这个方法，是要用特殊的引
物嘛？如果用普通的DNA引物，它们能够anneal to RNA嘛？
谢谢 |
x*****e
发帖数: 309 | 2 就是用你gene-specific primer作为引物，当然可以anneal to RNA，否则RTase没法起
作用。这种方法和T16N primer 相比，更适合3 UTR比较长的基因克隆吧。
【在 i********y 的大作中提到】
: 大家好，
: 问一个和我上个帖子类似的一个问题。我在网上看到有些公司说，可以在RNA反转录
: cDNA的时候，不用oligoDT或者hexamer, 而直接用gene-specific primer把一个基因给
: 扩出来。据他们说这个效率是最高的。我想问一下，如果用这个方法，是要用特殊的引
: 物嘛？如果用普通的DNA引物，它们能够anneal to RNA嘛？
: 谢谢
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s******y
发帖数: 28562 | 3 要用gene-specific primer. 可以用DNA oligo。 但是这个做法在我的经验里效率不高
（我怀疑那些公司瞎说）。
如果没有gene-specific primer，另外一种方法就是用5'-mRNA head structure 用烟
草病毒的一种酶来切掉之后再用RNA ligase来把一个已知序列的片断连上去，然后从那
个来扩增。
【在 i********y 的大作中提到】
: 大家好，
: 问一个和我上个帖子类似的一个问题。我在网上看到有些公司说，可以在RNA反转录
: cDNA的时候，不用oligoDT或者hexamer, 而直接用gene-specific primer把一个基因给
: 扩出来。据他们说这个效率是最高的。我想问一下，如果用这个方法，是要用特殊的引
: 物嘛？如果用普通的DNA引物，它们能够anneal to RNA嘛？
: 谢谢
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i********y
发帖数: 23 | 4 那sunny老师是否建议我先用oligoDT？如果oligoDt不work再用gene-specific primer?
【在 s******y 的大作中提到】
: 要用gene-specific primer. 可以用DNA oligo。 但是这个做法在我的经验里效率不高
: （我怀疑那些公司瞎说）。
: 如果没有gene-specific primer，另外一种方法就是用5'-mRNA head structure 用烟
: 草病毒的一种酶来切掉之后再用RNA ligase来把一个已知序列的片断连上去，然后从那
: 个来扩增。
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s******y
发帖数: 28562 | 5 我以前试验过好几种方法，包括我说的那个RNA ligation 的高大上方法，后来发现最
简单最有效的方法就是经典方法：
第一步. 用OligoDT做primer来合成cDNA
我推荐 SuperScript First-Strand Synthesis System
第二步.用基因特异的primer来克隆感兴趣的基因，注意引物要离基因的编码区的
开头(ATG)和结尾(Stop codon)至少有20bp距离（下面我会说原因）。如果基因
的GC含量高，可以用Herculase来做PCR, 不然的话我一般都直接用heat-activated Pfu
turbo.这样非特异带少。
第三步。如果上一步克隆得到的带太多，或者得到一个smear, 那么就再把得到的
产物简单过小柱子纯化后直接用nested primer重新再扩增一次，这样一般都可以
得到一个非常纯的条带。
Nested primer设计的时候必须在上一步用的引物的内侧（这个就是为什么第2步的引物
我告诉你说离开头和结尾有至少20bp距离,就是为了给Nested primer预留地方的）。
primer?
【在 i********y 的大作中提到】
: 那sunny老师是否建议我先用oligoDT？如果oligoDt不work再用gene-specific primer?
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x*****e
发帖数: 309 | 6 赞胖老师耐心，我一般第二步产物跑个胶，直接切下相应大小条带，纯化后用作nested
PCR template.
Pfu
【在 s******y 的大作中提到】
: 我以前试验过好几种方法，包括我说的那个RNA ligation 的高大上方法，后来发现最
: 简单最有效的方法就是经典方法：
: 第一步. 用OligoDT做primer来合成cDNA
: 我推荐 SuperScript First-Strand Synthesis System
: 第二步.用基因特异的primer来克隆感兴趣的基因，注意引物要离基因的编码区的
: 开头(ATG)和结尾(Stop codon)至少有20bp距离（下面我会说原因）。如果基因
: 的GC含量高，可以用Herculase来做PCR, 不然的话我一般都直接用heat-activated Pfu
: turbo.这样非特异带少。
: 第三步。如果上一步克隆得到的带太多，或者得到一个smear, 那么就再把得到的
: 产物简单过小柱子纯化后直接用nested primer重新再扩增一次，这样一般都可以
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m******5
发帖数: 1383 | 7 5'RACE么（就是胖头鱼说的，RNA-ligase mediated 5'RACE）其中一条引物就是GSP啊
【在 s******y 的大作中提到】
: 要用gene-specific primer. 可以用DNA oligo。 但是这个做法在我的经验里效率不高
: （我怀疑那些公司瞎说）。
: 如果没有gene-specific primer，另外一种方法就是用5'-mRNA head structure 用烟
: 草病毒的一种酶来切掉之后再用RNA ligase来把一个已知序列的片断连上去，然后从那
: 个来扩增。
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x*****e
发帖数: 309 | 8 低丰度的gene用gene-specific oligo 作为反转录引物据说效果好，效率不高可能和
gene-specific oligo设计以及RT酶有关。RT 一般42度，而普通PCR引物设计时候的退
火温度远高于42度， 可能设计6-12bp左右的gene-specific oligo效果比较好；选对模
板二级结构不怎么敏感的RT酶吧，能反转录的cDNA越大越好，6kb以上的应该就够了。
【在 s******y 的大作中提到】
: 要用gene-specific primer. 可以用DNA oligo。 但是这个做法在我的经验里效率不高
: （我怀疑那些公司瞎说）。
: 如果没有gene-specific primer，另外一种方法就是用5'-mRNA head structure 用烟
: 草病毒的一种酶来切掉之后再用RNA ligase来把一个已知序列的片断连上去，然后从那
: 个来扩增。
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s******y
发帖数: 17729 | 9 黄鼠狼下豆杵子的感觉
难道做RACE不是千老入门必杀技吗？
【在 i********y 的大作中提到】
: 大家好，
: 问一个和我上个帖子类似的一个问题。我在网上看到有些公司说，可以在RNA反转录
: cDNA的时候，不用oligoDT或者hexamer, 而直接用gene-specific primer把一个基因给
: 扩出来。据他们说这个效率是最高的。我想问一下，如果用这个方法，是要用特殊的引
: 物嘛？如果用普通的DNA引物，它们能够anneal to RNA嘛？
: 谢谢
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j*******u
发帖数: 81 | 10 不同方向和层次的千老起手式不一样。
据说会RACE的都是苦出生的。
真正的rising star连做cloning都不会就能当faculty
【在 s******y 的大作中提到】
: 黄鼠狼下豆杵子的感觉
: 难道做RACE不是千老入门必杀技吗？
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s******y
发帖数: 28562 | 11 哈哈，你说的有道理。可能是我们扩增基因的时候都没有耐心来优化那些条件，一旦发
现常规的方法弄不出来立刻就找公司去直接合成了，所以还没有机会来试验把引物弄短
一点会怎么样。
【在 x*****e 的大作中提到】
: 低丰度的gene用gene-specific oligo 作为反转录引物据说效果好，效率不高可能和
: gene-specific oligo设计以及RT酶有关。RT 一般42度，而普通PCR引物设计时候的退
: 火温度远高于42度， 可能设计6-12bp左右的gene-specific oligo效果比较好；选对模
: 板二级结构不怎么敏感的RT酶吧，能反转录的cDNA越大越好，6kb以上的应该就够了。
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w***a
发帖数: 4361 | 12 这年头，你要说自己会做cloning，简历立马被扔垃圾桶。
【在 j*******u 的大作中提到】
: 不同方向和层次的千老起手式不一样。
: 据说会RACE的都是苦出生的。
: 真正的rising star连做cloning都不会就能当faculty
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s******y
发帖数: 17729 | 13 原来是我的大开姿势不对，难怪苦逼了
【在 j*******u 的大作中提到】
: 不同方向和层次的千老起手式不一样。
: 据说会RACE的都是苦出生的。
: 真正的rising star连做cloning都不会就能当faculty
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i********y
发帖数: 23 | 14 谢谢sunny老师。不过我的是个LINC, 所以估计用不了nested primers.不过我今天订了
那个thermoscript.希望能够成功。
Pfu
【在 s******y 的大作中提到】
: 我以前试验过好几种方法，包括我说的那个RNA ligation 的高大上方法，后来发现最
: 简单最有效的方法就是经典方法：
: 第一步. 用OligoDT做primer来合成cDNA
: 我推荐 SuperScript First-Strand Synthesis System
: 第二步.用基因特异的primer来克隆感兴趣的基因，注意引物要离基因的编码区的
: 开头(ATG)和结尾(Stop codon)至少有20bp距离（下面我会说原因）。如果基因
: 的GC含量高，可以用Herculase来做PCR, 不然的话我一般都直接用heat-activated Pfu
: turbo.这样非特异带少。
: 第三步。如果上一步克隆得到的带太多，或者得到一个smear, 那么就再把得到的
: 产物简单过小柱子纯化后直接用nested primer重新再扩增一次，这样一般都可以
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