a**********2
发帖数: 28 | 1 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
-3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
任何意见或建议都欢迎〜 多谢！ |
f*******d
发帖数: 92 | 2 别这么费劲弄清楚你的细胞为啥子死了，直接去ATCC再买一管新的HEK好了。 |
a**********2
发帖数: 28 | 3 可我用它们两年了，一堆stable transfected的cell line，每个select都要花一两个
月，总不能全扔了重新开始，这太夸张了。。。
【在 f*******d 的大作中提到】
: 别这么费劲弄清楚你的细胞为啥子死了，直接去ATCC再买一管新的HEK好了。
|
s******s
发帖数: 13035 | 4 1.其他细胞有问题么？
2.是不是换了fbs
3.悬浮的是死了还是就是悬着长
4.有没有microplasma
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
|
a**********2
发帖数: 28 | 5 谢谢回复！
1.我有很多stable transfected的细胞，试着thaw了几瓶，大部分都活不下来，小部分
可以；实验室里没有其它人用HEK293，其它cell line例如CHO, NMuMG都很正常；
2.试过换新的FBS，也试过旧的，没什么区别；
3.应该是死了，这批是adhesion的，悬着好像不能长；
4.正在查。1月里forzen储存的细胞应该是没有。今天刚把一批悬浮死掉的细胞送出去
做mycoplasma检测。
【在 s******s 的大作中提到】
: 1.其他细胞有问题么？
: 2.是不是换了fbs
: 3.悬浮的是死了还是就是悬着长
: 4.有没有microplasma
:
: 有2
|
A******y
发帖数: 2041 | |
a**********2
发帖数: 28 | 7 用过新开封的trypsin，好像无关。。。
【在 A******y 的大作中提到】
: Probably your trypsin?
|
m**********3
发帖数: 706 | 8 I dont use trypsin for 293. Just shake your flasks and they will be flushed
out. Then you can spin down and split them. This will reduce the damage. |
s******s
发帖数: 13035 | 9 293没这么脆弱
突然想起来一点，是不是长过头了？ 记得这玩意儿不能长100%,
长到80%就要传了
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用过新开封的trypsin，好像无关。。。
|
D***s
发帖数: 5613 | 10 哈哈，感觉被人投毒了
【在 a**********2 的大作中提到】
: 谢谢回复！
: 1.我有很多stable transfected的细胞，试着thaw了几瓶，大部分都活不下来，小部分
: 可以；实验室里没有其它人用HEK293，其它cell line例如CHO, NMuMG都很正常；
: 2.试过换新的FBS，也试过旧的，没什么区别；
: 3.应该是死了，这批是adhesion的，悬着好像不能长；
: 4.正在查。1月里forzen储存的细胞应该是没有。今天刚把一批悬浮死掉的细胞送出去
: 做mycoplasma检测。
|
|
|
d**********t
发帖数: 20415 | 11 这个293T吧，293感觉还是挺难晃下来的，lz这个应该和trypsin没啥关系
flushed
【在 m**********3 的大作中提到】
: I dont use trypsin for 293. Just shake your flasks and they will be flushed
: out. Then you can spin down and split them. This will reduce the damage.
|
d**********t
发帖数: 20415 | 12 你试了几管都这样么？
看看你放细胞的液氮罐液氮level怎么样，我知道有实验室液氮没有及时灌，上面的细
胞都远远高于液氮了，好多细胞都复苏不出来
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
|
T****u
发帖数: 424 | 13 支原体。
买点抗支原体的chemical杀几次。
可以PCR检测一下。
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
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C******2
发帖数: 97 | 14 something is wrong with your DMSO. |
s******r
发帖数: 1245 | 15 293我都懒得放液氮罐里，扔-80度一年多了化开还都长的好好的
【在 d**********t 的大作中提到】
: 你试了几管都这样么？
: 看看你放细胞的液氮罐液氮level怎么样，我知道有实验室液氮没有及时灌，上面的细
: 胞都远远高于液氮了，好多细胞都复苏不出来
:
: 有2
|
y****y
发帖数: 123 | 16 在别的细胞上出过同样问题
花了一个多月快把冻的细胞用光了最后发现是血清的原因
FBS光换新的不行要换lot
后来要了几个lot的样品找到合适的买了一批自己专用的之后就没出过问题了 |
j*****9
发帖数: 716 | 17 我猜是medium出了问题，比如Glutamine。HEK293、COS-7对glutamine还是挺敏感的 |
A******y
发帖数: 2041 | 18 Then your cells are not Hek293. It is one of the worse attaching cell line.
【在 d**********t 的大作中提到】
: 这个293T吧，293感觉还是挺难晃下来的，lz这个应该和trypsin没啥关系
:
: flushed
|
a**********2
发帖数: 28 | 19 谢谢楼上各位的comments!
- mycoplasma: 把最新1月份冻下的vial送去检测，没问题；昨天把刚刚在culture里死
掉的细胞又送去了，还没拿到结果；
- 液氮:应该不会，实验室的液氮罐还是维护的不错的；
- 我的具体cell line是Flp-In™ T-REx™ 293, invitrogen的，非常容易
脱离plate，还很敏感：density太低会不爽；incubator水不足了会马上不爽；拿到
incubator超过15分钟也会不爽。总感觉这293没有传说中那么容易操作。。。也许最基
本的方面就有问题？ |
V******t
发帖数: 444 | 20 楼主我遇到过和你一样的问题，就是一是trypsin消化后，都成细条条、纤维状；二是
上次分过后，长得好好的，轻轻一晃就飘起来，成纤维状。
原因不明。我是重新弄了新的，重新保存。我检测过，没有支原体，也不是冻存的原因
，也不是培养基，也不是trypsin。很奇怪。希望楼主能搞清楚。
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
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b*******g
发帖数: 4 | |
s******s
发帖数: 13035 | 22 293就是这样的，很容易不爽。不过一般不爽就是产病毒效率低，
全飘起来比较少
【在 a**********2 的大作中提到】
: 谢谢楼上各位的comments!
: - mycoplasma: 把最新1月份冻下的vial送去检测，没问题；昨天把刚刚在culture里死
: 掉的细胞又送去了，还没拿到结果；
: - 液氮:应该不会，实验室的液氮罐还是维护的不错的；
: - 我的具体cell line是Flp-In™ T-REx™ 293, invitrogen的，非常容易
: 脱离plate，还很敏感：density太低会不爽；incubator水不足了会马上不爽；拿到
: incubator超过15分钟也会不爽。总感觉这293没有传说中那么容易操作。。。也许最基
: 本的方面就有问题？
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a**********2
发帖数: 28 | 23 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
-3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
任何意见或建议都欢迎〜 多谢！ |
f*******d
发帖数: 92 | 24 别这么费劲弄清楚你的细胞为啥子死了，直接去ATCC再买一管新的HEK好了。 |
a**********2
发帖数: 28 | 25 可我用它们两年了，一堆stable transfected的cell line，每个select都要花一两个
月，总不能全扔了重新开始，这太夸张了。。。
【在 f*******d 的大作中提到】
: 别这么费劲弄清楚你的细胞为啥子死了，直接去ATCC再买一管新的HEK好了。
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s******s
发帖数: 13035 | 26 1.其他细胞有问题么？
2.是不是换了fbs
3.悬浮的是死了还是就是悬着长
4.有没有microplasma
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
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a**********2
发帖数: 28 | 27 谢谢回复！
1.我有很多stable transfected的细胞，试着thaw了几瓶，大部分都活不下来，小部分
可以；实验室里没有其它人用HEK293，其它cell line例如CHO, NMuMG都很正常；
2.试过换新的FBS，也试过旧的，没什么区别；
3.应该是死了，这批是adhesion的，悬着好像不能长；
4.正在查。1月里forzen储存的细胞应该是没有。今天刚把一批悬浮死掉的细胞送出去
做mycoplasma检测。
【在 s******s 的大作中提到】
: 1.其他细胞有问题么？
: 2.是不是换了fbs
: 3.悬浮的是死了还是就是悬着长
: 4.有没有microplasma
:
: 有2
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A******y
发帖数: 2041 | |
a**********2
发帖数: 28 | 29 用过新开封的trypsin，好像无关。。。
【在 A******y 的大作中提到】
: Probably your trypsin?
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m**********3
发帖数: 706 | 30 I dont use trypsin for 293. Just shake your flasks and they will be flushed
out. Then you can spin down and split them. This will reduce the damage. |
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s******s
发帖数: 13035 | 31 293没这么脆弱
突然想起来一点，是不是长过头了？ 记得这玩意儿不能长100%,
长到80%就要传了
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用过新开封的trypsin，好像无关。。。
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D***s
发帖数: 5613 | 32 哈哈，感觉被人投毒了
【在 a**********2 的大作中提到】
: 谢谢回复！
: 1.我有很多stable transfected的细胞，试着thaw了几瓶，大部分都活不下来，小部分
: 可以；实验室里没有其它人用HEK293，其它cell line例如CHO, NMuMG都很正常；
: 2.试过换新的FBS，也试过旧的，没什么区别；
: 3.应该是死了，这批是adhesion的，悬着好像不能长；
: 4.正在查。1月里forzen储存的细胞应该是没有。今天刚把一批悬浮死掉的细胞送出去
: 做mycoplasma检测。
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d**********t
发帖数: 20415 | 33 这个293T吧，293感觉还是挺难晃下来的，lz这个应该和trypsin没啥关系
flushed
【在 m**********3 的大作中提到】
: I dont use trypsin for 293. Just shake your flasks and they will be flushed
: out. Then you can spin down and split them. This will reduce the damage.
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d**********t
发帖数: 20415 | 34 你试了几管都这样么？
看看你放细胞的液氮罐液氮level怎么样，我知道有实验室液氮没有及时灌，上面的细
胞都远远高于液氮了，好多细胞都复苏不出来
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
|
T****u
发帖数: 424 | 35 支原体。
买点抗支原体的chemical杀几次。
可以PCR检测一下。
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
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C******2
发帖数: 97 | 36 something is wrong with your DMSO. |
s******r
发帖数: 1245 | 37 293我都懒得放液氮罐里，扔-80度一年多了化开还都长的好好的
【在 d**********t 的大作中提到】
: 你试了几管都这样么？
: 看看你放细胞的液氮罐液氮level怎么样，我知道有实验室液氮没有及时灌，上面的细
: 胞都远远高于液氮了，好多细胞都复苏不出来
:
: 有2
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发帖数: 716 | 38 我猜是medium出了问题，比如Glutamine。HEK293、COS-7对glutamine还是挺敏感的 |
A******y
发帖数: 2041 | 39 Then your cells are not Hek293. It is one of the worse attaching cell line.
【在 d**********t 的大作中提到】
: 这个293T吧，293感觉还是挺难晃下来的，lz这个应该和trypsin没啥关系
:
: flushed
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a**********2
发帖数: 28 | 40 谢谢楼上各位的comments!
- mycoplasma: 把最新1月份冻下的vial送去检测，没问题；昨天把刚刚在culture里死
掉的细胞又送去了，还没拿到结果；
- 液氮:应该不会，实验室的液氮罐还是维护的不错的；
- 我的具体cell line是Flp-In™ T-REx™ 293, invitrogen的，非常容易
脱离plate，还很敏感：density太低会不爽；incubator水不足了会马上不爽；拿到
incubator超过15分钟也会不爽。总感觉这293没有传说中那么容易操作。。。也许最基
本的方面就有问题？ |
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V******t
发帖数: 444 | 41 楼主我遇到过和你一样的问题，就是一是trypsin消化后，都成细条条、纤维状；二是
上次分过后，长得好好的，轻轻一晃就飘起来，成纤维状。
原因不明。我是重新弄了新的，重新保存。我检测过，没有支原体，也不是冻存的原因
，也不是培养基，也不是trypsin。很奇怪。希望楼主能搞清楚。
有2
【在 a**********2 的大作中提到】
: 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
: 的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
: 具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
: thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
: passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
: -3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
: 我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
: plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
: 配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
: 版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
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b*******g
发帖数: 4 | |
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发帖数: 13035 | 43 293就是这样的，很容易不爽。不过一般不爽就是产病毒效率低，
全飘起来比较少
【在 a**********2 的大作中提到】
: 谢谢楼上各位的comments!
: - mycoplasma: 把最新1月份冻下的vial送去检测，没问题；昨天把刚刚在culture里死
: 掉的细胞又送去了，还没拿到结果；
: - 液氮:应该不会，实验室的液氮罐还是维护的不错的；
: - 我的具体cell line是Flp-In™ T-REx™ 293, invitrogen的，非常容易
: 脱离plate，还很敏感：density太低会不爽；incubator水不足了会马上不爽；拿到
: incubator超过15分钟也会不爽。总感觉这293没有传说中那么容易操作。。。也许最基
: 本的方面就有问题？
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r******k
发帖数: 446 | 44 我也碰到了一些问题 复苏的再passage 就不行了 总是还没长满就开始 变成
multilayer！ 好烦呀！ |
r******a
发帖数: 31 | |
