f*********8
发帖数: 129 | 1 用pipette tip? 需要加trypsin吗？
多谢 |
h*****n
发帖数: 2023 | |
f*********8
发帖数: 129 | 3 谢谢，再问一下
有哪里需要加trypsin，还是直接用tip刮下来，放到dish里？这样长会均匀吗？
【在 h*****n 的大作中提到】
: pipette tip
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b**********8
发帖数: 349 | 4 我最近也在做稳转，向实验室别人学的方法，待single colony形成至肉眼清晰可辨，
但是还没有互相融合之前，洗去medium，PBS漂洗一次，在dish背面用marker笔标记每
一个colony的位置，加TE润洗一次，（10ml dish加1ml TE，让TE在短时间内分布均匀
，立即吸去），等待1min后用白色的tips吸取10ul的新鲜medium（含选择抗生素）在每
一个colony上面来回轻轻吹打3~4次，然后全部转移到24孔板中，如此重复，效果挺好
。 |
f*********8
发帖数: 129 | 5 多谢。
【在 b**********8 的大作中提到】
: 我最近也在做稳转，向实验室别人学的方法，待single colony形成至肉眼清晰可辨，
: 但是还没有互相融合之前，洗去medium，PBS漂洗一次，在dish背面用marker笔标记每
: 一个colony的位置，加TE润洗一次，（10ml dish加1ml TE，让TE在短时间内分布均匀
: ，立即吸去），等待1min后用白色的tips吸取10ul的新鲜medium（含选择抗生素）在每
: 一个colony上面来回轻轻吹打3~4次，然后全部转移到24孔板中，如此重复，效果挺好
: 。
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c****g
发帖数: 93 | 6 这个说的比较全面了，再补充一点：我是直接弃medium，加上3～4ml的pbs别让它干掉
，然后用10ul的tips吸取10ul 胰酶用你说的方法即可；还有一点，弄个镜子在下面反
光透过dish，或者弄个台灯让光从下面投上来，克隆清晰可见。这个方法大好。
【在 b**********8 的大作中提到】
: 我最近也在做稳转，向实验室别人学的方法，待single colony形成至肉眼清晰可辨，
: 但是还没有互相融合之前，洗去medium，PBS漂洗一次，在dish背面用marker笔标记每
: 一个colony的位置，加TE润洗一次，（10ml dish加1ml TE，让TE在短时间内分布均匀
: ，立即吸去），等待1min后用白色的tips吸取10ul的新鲜medium（含选择抗生素）在每
: 一个colony上面来回轻轻吹打3~4次，然后全部转移到24孔板中，如此重复，效果挺好
: 。
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f*********8
发帖数: 129 | 7 谢谢。再问问：
single conoly一般多久可以在显微镜下看到？会不会到最后什么都没有，没有就重新
转吗？如果有，Positive的也不多？
【在 c****g 的大作中提到】
: 这个说的比较全面了，再补充一点：我是直接弃medium，加上3～4ml的pbs别让它干掉
: ，然后用10ul的tips吸取10ul 胰酶用你说的方法即可；还有一点，弄个镜子在下面反
: 光透过dish，或者弄个台灯让光从下面投上来，克隆清晰可见。这个方法大好。
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c****g
发帖数: 93 | 8 我做的是CHO cells， >10个细胞的一个克隆用我的方法基本能看到。一般的细胞及时
体积小点也应该是这个数量级吧。最后有没有clone还是依赖于你的效率，实在没有的
话就转染的plasmids多一些吧，我们一般10k cells/100mm dish，1-2ug plasmid，
48hr之后 add selection pressure。如果有clone，你后续的还要通过免疫组化或
western blot鉴定呢，通常positive的挺多的。
【在 f*********8 的大作中提到】
: 谢谢。再问问：
: single conoly一般多久可以在显微镜下看到？会不会到最后什么都没有，没有就重新
: 转吗？如果有，Positive的也不多？
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f*********8
发帖数: 129 | 9 谢谢。
我做的是U2OS,刚transfect了一星期，还不知道怎样。如果有多一点的resistant
clones那还好。后面会用western鉴定。就怕最后一个都没有，又要重来。
【在 c****g 的大作中提到】
: 我做的是CHO cells， >10个细胞的一个克隆用我的方法基本能看到。一般的细胞及时
: 体积小点也应该是这个数量级吧。最后有没有clone还是依赖于你的效率，实在没有的
: 话就转染的plasmids多一些吧，我们一般10k cells/100mm dish，1-2ug plasmid，
: 48hr之后 add selection pressure。如果有clone，你后续的还要通过免疫组化或
: western blot鉴定呢，通常positive的挺多的。
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