r**a
发帖数: 121 | 1 最近在做组织的FACS，用Trypsin和collagenase处理
我用的是10X Trypsin EDTA，后来发现EDTA是Trypsin和collagenase的抑制剂
Trypsin Inhibitors:
* Pancreatic-, soybean-, lima bean-, and egg white- trypsin inhibitors (
see section on Trypsin Inhibitors)
* DFP
* Aprotinin
* Ag+
* Benzamidine
* EDTA
Collagenase Inhibitors:
* EDTA, EGTA
* Cysteine, histidine
* DTT
* 2-mercaptoethanol
* o-phenanthroline
* Hg2+, Pb2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+
* Not inhibited by DFP or serum
(White and White ... 阅读全帖 |
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p*****n
发帖数: 981 | 2 ☆─────────────────────────────────────☆
honestman (snail) 于 (Sat Feb 10 22:26:27 2007) 提到:
大家做cell culture trypsinization的时候是：
1. 先加Trypsin, aspirate, 然后inculate， 然后加medium
还是
2. 加Trypsin, inculate， 然后直接加medium
或者是
3. 不同细胞做法不同
谢谢！
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honestman (snail) 于 (Sat Feb 10 22:27:08 2007) 提到:
顺便问下， 一般incubate多久？
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sunnyday (艳阳天) 于 (Sat Feb 10 22:31:50 2007) 提到:
先加少量，吸出来，再加适当的量，然后 incubate
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m*********D
发帖数: 1727 | 3 我的感觉是你over-treated.细胞成团往往是DNA出来的缘故。我看了我们的trypsin/
EDTA,我们用的是0。05%，比你的低五倍。
我一般的程序是：PBS洗一次后，T75加1-1。5 mltrypsin，用手转动flask,让trypsin
cover所有的细胞表面，然后把trypsin suck away。把flask放iincubator 3-5分钟就
可以了。不晃动，在microscope下改看到的都市单细胞。如果下不来，往往是PBS没洗
好，可以多洗一次。
肝细胞会例外。它们本来就抱团。这个只能靠needle来处理。 |
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B***v
发帖数: 113 | 4 很影响试验心情，是不是trypsin时间太长，还是trypsin浓度太高（0.25%）？
我摸索了一下还是经常成团。
哪位同学有经验？ |
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s*****y
发帖数: 32 | 5 我一般是trypsin把细胞消化好，就马上用血清中和。这样细胞就不会成团。 |
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G***G
发帖数: 16778 | 6 why second R in the following sequences are not trypsin cut site?
RRRPPPGSR
RRRFHAPIGLVAR |
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g*****x
发帖数: 3283 | 7 你说search fasta的时候？这个一般要设大一点，2。
trypsin的specificity和performance根本没那么好 |
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d***e
发帖数: 243 | 8 Trypsin, pepsin 等对LH receptor影响不大{Gospodarowicz 1973}. 所以也可能是其它
的一些原因：cells condition, monolayer overlapping之类的问题.当然commercial
trypsin function本身就比较复杂，有时有些人就用较纯化或重组的trypsin和胶原酶之
类成份确定的混合物去消化。
我的感觉是你是否让你的宝贝细胞刚长得90%confluence后，hanks washing triple,再用
0.05%trypsin在不同温度（Rm, 36）消化一下看有没有提高。
实在不行就定些Cell Dissociation Buffer or Enzyme Free Dissociation
Reagents(60% confluence)，但我总认为是花拳秀腿，但也许就对你的实验管用。
另外培养界面，polypropylene, glass, teflon-coated 都是option,但我对这些不熟悉
。可能还有几个较流氓的方法，冰水超声,内置tiny cover slides, 瞬时低渗 |
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l****j
发帖数: 70 | 9 我找的protocol上用的是0.25% trypsin在 4C overnight让trypsin完全浸入组织,然后
在 37C 30min 消化分离第一代，之后传代都用0.05% trypsin，但消化很困难，所以我
用了0.1%的trypsin,这样是会过度消化吗？
will |
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发帖数: 1 | 10 小弟最近用SH-SY5Y做CRISPR。CRISPR本身是没问题的，但在single cell expansion的
步骤出了问题。
稀释法得到的单细胞在96孔板里生长大概一个星期，就长成一团细胞。但接着细胞就“
扩张”不下去了，只会在那一小团里越长越密，而不像其他细胞可以容易的长满整个96
孔板。
这时候我就用常规的Trypsin来消解，把这一团细胞打散。可问题是，这样处理后细胞
很快就死掉了。
我想请教：
1. SH-SY5Y从单细胞是否可以长满整个96-well的孔？这个细胞可以从single cell长成
一团，为何就无法继续扩张下去了呢
2. 我的问题主要出在哪里呢？我个人分析觉得最大可能是Trypsin过于harsh。而且我
在操作过程中可能Trypsin incubation的时间过长。那么有没有什么相对温和的
Trypsin可以替代呢？我网上查到比如Accutase，不知道大家还有什么别的推荐？
3. 除了SH-SY5Y, 还有什么其他human neuronal cell line推荐呢？感觉神经细胞总是
挺脆弱的。
非常感谢！ |
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x*****9
发帖数: 68 | 11 1）biotin label protein 经过trypsin digestion过avidin bead， 不知道原来溶液
里面的urea会不会干扰biotin和avidin的binding
2）看到cravatt的文章， on-bead trypsin digestion， 问题是trypsin不会把bead
上面的avidin也digest么？
谢谢 |
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s******y
发帖数: 28562 | 12 谢谢解释。
我其实从来不认为这个Bt protein 有急性毒性。尤其是因为酸会让它变性。即使你把0
.2g 蛋白粉一次性的用水灌进去，除非那些蛋白粉是用碱性溶液冲调的，否则只要胃酸
还在，最后的溶液还是酸性的（虽然酸性会弱一些在），所以这个就会产生很多不能直
接推断的后果。直接测量的方法很多，要么把老鼠打开看看是不是真的进入肠道了，要
么把蛋白粉用肠溶片包裹再灌老鼠。
另外，至于人的trypsin protease 能不能正确切开Bt protein? 就我对trypsin 的理
解，可能性非常的大。我刚才随手查了一下相关文献，发现他们是随便用了sigma 生产
的牛的trpsin来做的Bt protein切割实验.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC203675/?page=1
所以人的trypsin 几乎毫无疑问是可以切出正确构型的。
至于说Bt protein的特异性，其实是依赖于它对cadherin 的特异性。它对于不是磷翅
目的生物的cadherin的结合程度不高。但这个不可能一点都不结合，因为cadherin 在
不同... 阅读全帖 |
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x*****9
发帖数: 68 | 13 1）biotin label protein 经过trypsin digestion过avidin bead， 不知道原来溶液
里面的urea会不会干扰biotin和avidin的binding
2）看到cravatt的文章， on-bead trypsin digestion， 问题是trypsin不会把bead
上面的avidin也digest么？
谢谢 |
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i****w
发帖数: 38 | 14 故事有点长，写的有些乱，但可能对大家有帮助，同时也寻求大家的帮助。
情况有些复杂。今年六月份，我的印度老板（他也是系主任）很不好意思的跟我说不跟
我续下一年的合同（DS2019的终止日期是12-15-2011），让我开始找工作。同系的一个
台湾老板知道后，主动来找我说让我到他实验室去。他的实验室情况是，只有他老婆一
人，两个人来到这个系里刚刚两年，还没有拿到R01，手里的starting funding到明年9
月底截止，让我跟他拼一年，出些文章。这个台湾老板是assistant professor，发过
Cell和Molecular Cell的一作，他老婆也发过Gene Dev的文章，是assistant research
professor, 我本人并不害怕work hard，而且考虑到老婆在附近的工作，所以也就答
应了。9月底的时候，我在印度老板实验室的一作文章被接受了，他就跟台湾老板商量
，让我先去台湾老板实验室做，同时等学校的paper work，但这只是他们私下的协议，
不能公开。
我加入台湾老板实验室后，噩梦就开始了。他对我的paper work的事并不热心，而且对
我也... 阅读全帖 |
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G***a
发帖数: 27294 | 15 首先，豆浆（黄豆）里面有的不是蛋白酶，是蛋白酶抑制剂。确切地说，是胰蛋白酶抑
制剂
即soybean trypsin inhibitors
其次，绝大多数实验证明，soybean trypsin inhibitors对人体胰腺蛋白酶没有任何有
害作用
甚至有人说它将来可以用于胰腺癌症的研究。
最后，即便有害，这个东西，加热就能完全灭活。实在害怕，把豆浆煮开了喝，大分子
都变性解旋了
怎么能刺激肠道壁粘膜呢？
具体参见以下文献
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7036513 |
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v******s
发帖数: 6949 | 16 http://en.wikipedia.org/wiki/Antinutrient
Phytic acid has a strong binding affinity to minerals such as calcium,
magnesium, iron, copper, and zinc. This results in precipitation, making the
minerals unavailable for absorption in the intestines.Phytic acids are
common in the hulls of nuts, seeds and grains.
Protease inhibitors are substances that inhibit the actions of trypsin,
pepsin and other proteases in the gut, preventing the digestion and
subsequent absorption of protein. For example, Bowma... 阅读全帖 |
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p******n
发帖数: 330 | 17 有人在养hepG2细胞吗
正在养这个细胞。发现这种细胞很难养，不仅不能单层贴壁，很容易成团生长外，用非
酶消化液（non-enzyme buffer）消化后居然能死一半。由于需要上流式细胞仪，hepG2
又是贴壁细胞，所以必须要detach，但是这个损伤消耗不起呀。而且我的实验是不能用
trypsin来消化细胞，因为trypsin会让我损失一些细胞表面的膜蛋白。我用非酶消化液
消化的时间很短，只有1分钟，消化后立即洗涤，我分别检测了消化后在不同温度下孵
育半小时和一小时，时间没有让细胞死亡率增加，但是温度对其有影响。（我是用PI染
色鉴定细胞死亡的）
有没有同学在养这个细胞，能不能分享一下经验。我的细胞是从ATCC买的，所有的细胞
相关用品，如medium等都是购自ATCC，按其官网上的要求做到。或许有同学的细胞从别
的地方买的，会更好养一些呢。 |
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N******o
发帖数: 3053 | 18 如果你需要细胞密度很高做实验的话，可以先多个Plate养，然后收集起来加到
RetroNectin（Takarabio，Japan)修饰Plate上面。
RetroNectin个破东西超级厉害，当然也是超级贵，你只有用高浓度Trypsin才能剥离细
胞，而且剥离后一定加入PBS冲开细胞，如果你加入培养液，里面的血清中和Trypsin以
后细胞又被RetroNectin粘上去了。 |
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I*****y
发帖数: 6402 | 19 use trypsin to digest your protein overnight, and the amount of trypsin
needs to be higher to digest your protein into individual amino acids. my $0
.02 |
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h********n
发帖数: 4079 | 20 Can you buy collagenase (I am not sure about subtype) and use as trypsin.
a few years ago I used collagen coated dish to culture cells, when I need to
harvest cell, I used a mixture of collagenase and trypsin.
you might need to optimize the system. |
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z****g
发帖数: 3340 | 21 想找一个人的细胞表面分子marker能抗trypsin digestion 或对trypsin digestion不
太敏感。搜了半天没有任何有用的信
息。 |
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s********g
发帖数: 91 | 22 现在需要一种酶水解蛋白成氨基酸，老板让试pronase E， 作了一次，LC—MS，啥峰也
没找到。我是按照trypsin的protocol 做的，是不是不能用trypsin的方法呀？
我对蛋白这一块一点都不懂，瞎折腾了很久，一点结果都没有。请问哪位大侠做过蛋白
彻底水解的，请给点建议，如果你有好的protocol， 可不可以发给我一份，小女子在
此不胜感激。
多谢。 |
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K******S
发帖数: 10109 | 23 trypsin cuts K/R EXCEPT KP/RP and when there are acidic amino acids around
like E, you will expect miss cleavage. And trypsin usually have 1-2 miss
cleave depending on individual protocol. (You will have to try it on some
standard proteins to find out the usual miss cleavage rate)
It's normal that same peptide appears more than once (assuming from LC-
MS/MS data) because there are a lot of data points during peptide elution
time. Some instrument setting can eliminate it to a certain level. But f... 阅读全帖 |
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f*******g
发帖数: 35 | 24 最近在养293T cells, 转染或者未转染的293T细胞放在FASC buffer (PBS+5% FBS）中
，然后在室温或者ice上放置两到三个小时，用7-AAD染色，发现60%的细胞都是 7-AAD+ （做 FACS的时候离 trypsinization差不多5-6小时吧）。刚刚trypsinized的细胞，然后立即作FACS， 7-AAD+的细胞比例很低，只有1-2%左右吧。
请问这种情况正常么？
我看到有的paper上， 293T细胞在室温或者冰上放置16个小时，然后用相应的抗体染色
，然后FACS 分析。 这种情况难道所有的293T 细胞不会全部死掉么？ 如果细胞都死了
，应该都会被染色吧 ？
高手来分析一下吧？谢谢！ |
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S*****s
发帖数: 287 | 25 你是不是检查一下你的 FACS Buffer？ 比如PBS 的 pH 值，是 1X 还是 10X PBS，FBS
有没有过期，或者 7-AAD 买了多久了？我也用 293T 做 Flow，样品分解成单细胞后
要花六到七个小时染色，然后每个样品里加 7-AAD 做对照。我的样品里 7-AAD
positive 的细胞都不多。我在 Negative 的细胞里 gate 一部分出来作为 P1，P1 一
般都在 70% 以上，另外有一部分 Negative 的细胞 FSC 和 SSC 值都很大我都不分析
了。你这个 50-60% 听起来有点吓人。或者你换一个染料来做这个实验，比如 DAPI？
如果 DAPI 的值和 7-AAD 的不一样说明两个药品当中有一个坏掉了。
AAD+ （做 FACS的时候离 trypsinization差不多5-6小时吧）。刚刚trypsinized的细
胞，然后立即作FACS， 7-AAD+的细胞比例很低，只有1-2%左右吧。 |
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W*********n
发帖数: 775 | 26 谢谢艳阳天！
和我们这边作质谱的老师交流，问他用什么样的裂解液最适合后面的LCMSMS分析，他说
“Since you’re running the samples on a gel before trypsin digest, don’t
worry about the buffers; use whatever you want. ” 然后我就把上面那封邮件发
给他，他回复“I don’t think urea is a good idea, since it will cause
problems for your gel (very difficult to totally remove). I would be
careful during your gel digest…make sure you do plenty of washes to remove
the protease inhibitors before the trypsin step. ”
我晕死了，他都说use whatever you want了，我找了大家认为很好的Urea方法，结果
他又说not... 阅读全帖 |
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c****g
发帖数: 93 | 27 这个还要看如何挑法：如果不用trypsin直接挑老快了，用trypsin会比较慢，不过细胞
会比较分散，状态也好 |
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h***a
发帖数: 145 | 28 可以用trypsin吗？我们用了0.25%trypsin处理6个月的小鼠的hypothalamus 20mins at
37C,怎么感觉完全没消化啊。
用pasteur pipets 吹打的时候完全吸不进去。。崩溃。
高手指点一下吧。多谢啦！ |
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a*******g
发帖数: 33 | 29 试了ice cold PBS，细胞也是岿然不动。trypsin有说会消化掉细胞表面抗原，大家做
macrophage会用trypsin、EDTA一起来消化脱壁吗？ |
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i***0
发帖数: 160 | 30 I have tried the Invitrogen enzyme-free cell dissociation solution,
dissociation is slower than trypsin, and milder. Better use that instead of
trypsin, if your assay is related to membrane proteins or cell membrane. |
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h******y
发帖数: 351 | 31 你这消化的时间太长了。
我的方法给你参考。
E13.5或E14.5，去头去内脏，转到一个预先装有0.25%Trypsin-0.53mM EDTA的3mL注射
器里，从20G的针头中挤过。如果组织块太大的话，多挤几次。然后在37C消化5分钟。
用FBS终止酶消化，离心收集组织和细胞，用5mL pipette重悬。每1-2个胚胎可以铺一
个10cm的dish。一两天后就长满了，这算P0。需要注意的是所有和组织接触的塑料器皿
用前需要先润湿，否则组织很容易粘到上面。
传代用0.25%Trypsin-0.53mMEDTA，37C，3-5分钟。这算P1。从这里起，seeding
density在4-5 X 10^3/cm2. 3-4天或者接近长满的时候分一次。一般在第2或3次的时候
冻足够多的细胞，1x10^6/vial. 运气好的话，一只孕鼠的6-8个胚胎分出来的MEF足够
你用的了。 |
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a******n
发帖数: 392 | 32 老鼠干细胞可以trypsinize后中和，然后直接加20％DMSO。可是人干细胞不能
trypsinize啊？ |
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V******t
发帖数: 444 | 33 楼主我遇到过和你一样的问题，就是一是trypsin消化后，都成细条条、纤维状；二是
上次分过后，长得好好的，轻轻一晃就飘起来，成纤维状。
原因不明。我是重新弄了新的，重新保存。我检测过，没有支原体，也不是冻存的原因
，也不是培养基，也不是trypsin。很奇怪。希望楼主能搞清楚。
有2 |
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V******t
发帖数: 444 | 34 楼主我遇到过和你一样的问题，就是一是trypsin消化后，都成细条条、纤维状；二是
上次分过后，长得好好的，轻轻一晃就飘起来，成纤维状。
原因不明。我是重新弄了新的，重新保存。我检测过，没有支原体，也不是冻存的原因
，也不是培养基，也不是trypsin。很奇怪。希望楼主能搞清楚。
有2 |
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c********n
发帖数: 225 | 35 实验流程第三步：
3.Genomic DNA extraction
更新前
3-1 48-60 hours after transfection, cells are harvested by trypsin digestion
. Four wells of cells are combined into a 1.5 ml EP tube.
3-2 For genomic DNA extraction, 500 μl of cell lysate buffer (50 mM Tris，
100 mM EDTA，0.5% SDS，pH 8) and 10 μl proteinase K (10 mg/ml）are added
into each tube and mixed gently and sufficiently. Bathe the tubes at 55℃
for 2 hours.
3-3 200 μl Tris-Phenol and 200 ul trichloromethane are added into each tube
and mixed gently and ... 阅读全帖 |
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g*****n
发帖数: 241 | 36 我正在做一个实验需要把worm protein lysate做proteomics的分析(TMT labeling)。
我现在用的buffer是6M Guanidine HCL in PBS，5mM DTT， pH8.5 。用研砵破碎虫子
之后用氢氧化氨把pH值重新调回8.5，然后65度半小时，离心取上清给mass spec
facility的人。但他们告诉我说trypsin digestion的效率不高，怀疑我的buffer可能
有抑制trypsin digestion的成分。
我想问问大家有没有什么成熟的protocol或者buffer recipe。谢谢！ |
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X*******8
发帖数: 3895 | 37 刚才看有人在“请教一个转基因问题”，故把下面一篇文章转过来，没有翻译，有兴趣
的自己看吧。
http://www.holistichealthsecrets.com/alternativehealth/genetica
modified-foods-healthy-to-eat/
Are Genetically Modified Foods Healthy to Eat?
July 14th, 2009adminLeave a commentGo to comments
The topic of Genetically Modified Food (GMOs) can be confusing. On one side
we have big Pharma
companies touting studies that show that Genetically Modified Food is
perfectly safe for consumption. On
the other hand, we have wholistic health groups and speakers s... 阅读全帖 |
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X*******8
发帖数: 3895 | 38 读读这个吧，没有翻译，有兴趣
的自己看吧。AAEM的人你不因该叫民科了吧？另外，谁把我关于先锋分类的贴删了？每
必要这么害怕吧？
http://www.holistichealthsecrets.com/alternativehealth/genetica
modified-foods-healthy-to-eat/
Are Genetically Modified Foods Healthy to Eat?
July 14th, 2009adminLeave a commentGo to comments
The topic of Genetically Modified Food (GMOs) can be confusing. On one side
we have big Pharma
companies touting studies that show that Genetically Modified Food is
perfectly safe for consumption. On
the other hand, we have wholistic health gr... 阅读全帖 |
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f******I
发帖数: 769 | 39
antioxidants
you have to see a lung guy to get more detailed answers, to me clinically
COPD means emphysema, chronic bronchitis, and asthma, you can keep asthma
out of this since it seems to have different immune mediators with
eosinophils being involved,
for emphysema it is the destruction of small airways, you don't necessarily
have to have deficit endogenous production of alpha 1 anti-trypsin, tobacco
use, for instance, will activate macrophage and neutrophils to release
multiple proteinase |
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C*******h
发帖数: 75 | 40 我的两孩子大约是出生两个月以后同时开始出现湿疹，当时的情况和您描述的有过之而
无不及，理解您的心情。我们用过所有能用的办法，包括(1)减少衣服以免穿得过多，(
2)涂油保持皮肤湿润，(3)经过 TRYPSIN 降解的特殊奶粉，(4)查过敏源等等， 但都无
济于事， 5)最后我们使用激素 HYDROCODISON 才得以摆脱困境。当然 这些都是在医生
的指导下做的。
以防宝宝自己抓破皮肤而出现感染， 我们给宝宝戴柔软的手套。
祝您小宝宝早日摆脱湿疹。 |
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j**f
发帖数: 7403 | 41 没错，那个医生建议，SOY FORMULAR彻底从市场上消失，因为太毒。
而如果对牛奶过敏，还有其他选择，可以去我贴的视频里面去找。
我刚看到的其他两个文章也说要BAN豆奶粉。
http://factoidz.com/soy-products-healthy-or-unhealthy/
这个文章解释了豆制品里面含有的N种东西，以及他们分别有什么危害和好处：
Soy products contain phytic acid, trypsin inhibitors, lysinoalanine,
nitrosamines, and phytoestrogens.
每一种都解释了，并且给了RESEARCH的出处。最后文章的建议是：
oy products are best consumed in moderation to obtain the benefits they
offer without any of the potential negative consequences. So while soy is
healthy it is probably best to make s... 阅读全帖 |
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q*d
发帖数: 22178 | 42 ☆─────────────────────────────────────☆
swjtuer (swjtuer) 于 (Tue Mar 30 23:56:30 2010, 美东) 提到:
星期一
早餐 牛奶，煮鸡蛋，玉米馒头，榨菜
早点 芦柑
午餐 中大：绿豆饭，木须肉，海米冬瓜，棒骨菠菜汤
小婴：绿豆饭，三叶瓜炒肉，海米冬瓜，棒骨菠菜汤
午点 冰糖山楂水，蔬菜饼
晚餐 棒骨冬苋菜瘦肉粥，卤肉秋叶夹馍
星期二
早餐 牛奶，蒸鸡蛋，枣泥糕
早点 香蕉
午餐 中大：胡萝卜饭，芹菜炒牛肉，珊瑚豆腐，棒骨凤尾汤
小婴：胡萝卜饭，芹菜炒肉，珊瑚豆腐，棒骨凤尾汤
午点 果汁，卤猪肝
晚餐 豌豆肉末焖饭，番茄虾皮紫菜汤
星期三
早餐 南瓜粥，卤蛋，如意肉卷
早点 脐橙
午餐 中大：金银饭，咸烧白，海米儿菜，棒骨冬苋菜汤
小婴：金银饭，樱桃肉，海米儿菜，棒骨冬苋菜汤
午点 牛奶，蛋卷
晚餐 米饭，蒜苔炒肉，芙蓉蒸蛋，棒骨海带萝卜汤
星期四
早餐 牛奶，蒸鸡蛋，奶香馒头
早点 苹果
午餐 中大：南瓜饭，什锦鱼丸，韭菜炒豆干，番茄菌类鱼汤
... 阅读全帖 |
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g**p
发帖数: 32 | 43 先声明我不知道正确答案，跟各位讨论一下而已。
蛋白酶水解底物时应该有构象变化，从结合底物，识别酶切位点，水解反应，到释放底物
这样的多步
过程每一步都会有构象变化，而且构象变化是酶活性的必要条件。
多太抑制剂可能会以较高的亲和力与胰蛋白酶结合，然后将其固定在某一构象，从而抑制
其酶活。
正因为如此，虽然此抑制剂有Arg或Lys位点，也不能被水解。 |
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g***m
发帖数: 465 | 44 hehe, it is a basic strategy via accurate MS for proteomic level's screening
and identifying.
The precision is really dependant on how you construct the peptide map
database. Generally, they take cDNA translated amino acid sequence as actual
proteins, then do a in silica proteolysis with trypsin, input the results into
the database.
This approach is really database dominating. Not mention possible
post-translational modification and signal peptides and so on that could bring
a big trouble. |
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t**d
发帖数: 52 | 45 如果8小时还没有附着的话，细胞肯定死了
不知道你的floating cells多不多，占多大比例？如果数目很少的话western,ladder根本
无法解决问题
我目前也在做这方面的研究，我通常使用flow cytometer来检测subG1或caspase,
但也需要有一定数量的细胞，fibrobalst实际上很容易培养的，你研究中出现的现象我也
遇到过，认为很可能是trypsin处理过头了，如果附着细胞还有不少，你可以把浮游的去
掉，继续培养剩下的细胞。
请问如何鉴定这些floating的细胞仅仅是floating而没有dying，还是它们已经进入cell
， |
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E**O
发帖数: 62 | 46 蛋白酶的确可以自我降解，这也是为什么trypsin之类的东西浓度不能太高的原因 |
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t*********i
发帖数: 35 | 47 MSC细胞
在显微镜下看，培养液中有些死细胞，还有少量黑色点点在培养液里。
但外观看培养液还是清澈的
今天是seed之后的第二天
这是污染了么？
但是我是重新配得的培养液，新打开的FBS。。。还加了PS（1%）
会是trypsin污染了么？
感谢各位帮助！ |
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w***e
发帖数: 269 | 48 细菌污染是最好辨认的.显微镜下看细菌形状规则,颗粒状,细小,大小均一,就像一层沙
子,要是蛋白质杂质或者细胞碎片,都是大大小小形状无规则.有的细菌长的慢.我有次细
胞感染细菌,每次都是六七天后才很明显.所以你可以把细胞养久一些,确定没有问题之
后再做后面的实验.再贡献一点经验,如果细胞确定感染细菌了,别费心思慢慢排除是什
么原因,也不要省钱.所有的东西(medium, trypsin,serum etc)全部扔掉,都用新的.然
后cell culture hood里面东西全部扔掉,cell culture hood里面仔细用70%酒精擦干一
遍.incubator里面的夹层隔板能拿出来的都拿出来autoclave.再用70%酒精把incubator
里面擦一遍.如果是细菌感染的话,问题应该就被解决了. |
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m******i
发帖数: 73 | 49 Trypsin usually cuts proteins at K or R. If I use higher concentration, is
it going to digest other amino acids?
Thanks.
$0 |
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K******S
发帖数: 10109 | 50 then why need to cut protein into amino acids? plenty other proteolytic
enzymes, you can even use trypsin, it will just cut the next K/R
very
. |
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