c**i
发帖数: 265 | 1 老板突然要做inducible apoptosis，不知Staurosporine可以么？ 我看到Progema的
Caspase－9 GLo kit 用这个诱导Jurkat cells， 不知能不能用在HEK293上？ 谢谢。 |
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a**********2
发帖数: 28 | 2 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
-3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
任何意见或建议都欢迎〜 多谢！ |
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a**********2
发帖数: 28 | 3 谢谢回复！
1.我有很多stable transfected的细胞，试着thaw了几瓶，大部分都活不下来，小部分
可以；实验室里没有其它人用HEK293，其它cell line例如CHO, NMuMG都很正常；
2.试过换新的FBS，也试过旧的，没什么区别；
3.应该是死了，这批是adhesion的，悬着好像不能长；
4.正在查。1月里forzen储存的细胞应该是没有。今天刚把一批悬浮死掉的细胞送出去
做mycoplasma检测。 |
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j*****9
发帖数: 716 | 4 我猜是medium出了问题，比如Glutamine。HEK293、COS-7对glutamine还是挺敏感的 |
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A******y
发帖数: 2041 | 5 Then your cells are not Hek293. It is one of the worse attaching cell line. |
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a**********2
发帖数: 28 | 6 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
-3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
任何意见或建议都欢迎〜 多谢！ |
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a**********2
发帖数: 28 | 7 谢谢回复！
1.我有很多stable transfected的细胞，试着thaw了几瓶，大部分都活不下来，小部分
可以；实验室里没有其它人用HEK293，其它cell line例如CHO, NMuMG都很正常；
2.试过换新的FBS，也试过旧的，没什么区别；
3.应该是死了，这批是adhesion的，悬着好像不能长；
4.正在查。1月里forzen储存的细胞应该是没有。今天刚把一批悬浮死掉的细胞送出去
做mycoplasma检测。 |
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j*****9
发帖数: 716 | 8 我猜是medium出了问题，比如Glutamine。HEK293、COS-7对glutamine还是挺敏感的 |
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A******y
发帖数: 2041 | 9 Then your cells are not Hek293. It is one of the worse attaching cell line. |
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s**********e
发帖数: 2888 | 10 再说一个例子，威州的republican议员认为不应该使用胚胎组织或者来源于胚胎的材料
用于研究，按照前面的人的说法，自己不用胚胎组织或者材料做研究好了，管别人用不
用。
但是呢，这些议员推出一个法律，规定所有威州的大学都不可以使用胚胎组织，包括
HEK293细胞。HEK293细胞最开始是来源于胚胎（也许几十年前分离的），但是后来早就
是immortalized cell line, 大家都可以从ATCC买到，和胚胎没有任何关系。HEk293细
胞又偏偏是很多研究很重要的一个部分；最后UW-Madison学校出具声明，说这个决议干
扰正常科研，而且属于无理取闹。 |
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发帖数: 1 | 11 Me again,
Tried a different region again in my cell type that I had edited
successfully with CRISPR-Cas9 in HEK293 (note that these are not the cells I
'm trying now). The guides are essentially the same except for 2 extra bp on
either side of the sgRNA sequence. Tried a number of different combinations
for nucleofection but no deletions. The first lane is PCR from edited
HEK293 gDNA that I had from before, the rest of the lanes are various
combinations of NgAgo plasmid with two 24mer 5'P guides... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 12 薪酬福利
1. 优秀员工将有美国进修与工作机会,并提供H1B工作签证;
2. 安必奇不但关心员工的薪资待遇（硕士年薪10～12w；国内博士年薪15w~25w；海
归博士年薪25w～35w）,更关心员工的生活和个人发展;
3. 优秀员工解决北京、天津、上海户口
工作地点：北京、天津、上海、西安、成都、美国
北京公司地址：北京经济技术开发区力宝广场B13-2606
上海公司地址：张江药谷大厦
天津公司地址：天津经济技术开发区洞庭路220号天津国际生物医药联合研究院
西安公司地址：西安市未央区凤城一路与未央路十字东北角利君V时代A座1404
成都公司地址：成都市高新区盛和一路88号康普雷斯大厦A栋1206
美国公司地址：美国纽约长岛
应聘流程与投递简历
投递简历（[email protected]/* */）——简历筛选——电话面试——现场面试—
—专业测试——offer发放
有意者请通过以下方式投递简历。
接收简历邮a class="__cf_email__" href="/cdn-cgi/l/email-protection" data-cfemail="a... 阅读全帖 |
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y****6
发帖数: 196 | 13 HEK293 cells in 96-well plate, DMEM with 10% FBS, cultured 2d, about 100%
confluency.
Washed once with PBS before adding fixation solution (3.7% formaldehyde/PBS).
Cells detached in fixastion solution. Is it because formaldehyde does not
work with HEK293 cells? Anyone tried methenol? What's the concentration? |
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p********e
发帖数: 61 | 14 兄弟是想做什么样的抗体? 多抗？单抗? 多抗多为兔多抗，也可以做羊，马，牛之类的。
单抗也分为小鼠，大鼠和兔子。
如果谷歌一下“Custom Antibody”， 广告铺天盖地，Organic结果更是浩如烟海。选
哪家确实让人头痛。我以前做为客户从其他公司定制过抗体(Genscript, Sigma等)，给
公司打工时也给客户做过不少抗体，现在我所在的公司也在做定制抗体，所以我对现状
还是了解一些的。下面给大家一些我的个人观点。
像马牛羊驴甚至骆驼这类大动物的多抗多用于二抗或给病人紧急用（蛇素狂犬之类的）
，这东西贵得去了，大家用不着。最常用的还是四类：兔多抗，小鼠单抗，大鼠单抗和
兔单抗。兔杂交瘤的专利好象还没过期，所以只能由Epitomics或与之相关的公司做，
其他大家都可以做。技术上，无论单抗还是多抗，实在是没有什么难度，任何一个生物
WSN租间房子养几只动物（不需要无菌，敞开养就行）就可以搞起来。成功的关键主要
有两点：1. 抗原； 2. 多做几只。
抗原好，做抗体很容易，抗原不好，神仙也没用。做免疫的可能都用过Ova，就是鸡蛋
里的白蛋白。这玩意儿往无论是老鼠还是兔子体内一... 阅读全帖 |
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p********e
发帖数: 61 | 15 兄弟是想做什么样的抗体? 多抗？单抗? 多抗多为兔多抗，也可以做羊，马，牛之类的。
单抗也分为小鼠，大鼠和兔子。
如果谷歌一下“Custom Antibody”， 广告铺天盖地，Organic结果更是浩如烟海。选
哪家确实让人头痛。我以前做为客户从其他公司定制过抗体(Genscript, Sigma等)，给
公司打工时也给客户做过不少抗体，现在我所在的公司也在做定制抗体，所以我对现状
还是了解一些的。下面给大家一些我的个人观点。
像马牛羊驴甚至骆驼这类大动物的多抗多用于二抗或给病人紧急用（蛇素狂犬之类的）
，这东西贵得去了，大家用不着。最常用的还是四类：兔多抗，小鼠单抗，大鼠单抗和
兔单抗。兔杂交瘤的专利好象还没过期，所以只能由Epitomics或与之相关的公司做，
其他大家都可以做。技术上，无论单抗还是多抗，实在是没有什么难度，任何一个生物
WSN租间房子养几只动物（不需要无菌，敞开养就行）就可以搞起来。成功的关键主要
有两点：1. 抗原； 2. 多做几只。
抗原好，做抗体很容易，抗原不好，神仙也没用。做免疫的可能都用过Ova，就是鸡蛋
里的白蛋白。这玩意儿往无论是老鼠还是兔子体内一... 阅读全帖 |
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s*****i
发帖数: 315 | 16 HEK293 是人胚肾细胞，应该是间质细胞或是上皮细胞来源的永生化细胞系
293T是经过largeT antigen transform的 HEK293 细胞系 |
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s*****a
发帖数: 59 | 17 用的是pcDNA3，HEK293和600ng/ul G418
Transfection48小时后1:10 subculture开始做selection---P1
4days later, P1细胞confluent，开始subculture 到P2，split ratio 分别是1:10, 1
:30, 1:100, 1:300
10 days later, P2的1:10细胞也confluent，1:300细胞可以看到single colony，但是
比较密集不容易pick up。
我现在能不能用P2的1:10细胞再做一次1:100的subculture，等几天后看到比较分散的
colony后再做pick up? 这样是否相当于从P1开始1:1000 subculture？
但是另一个博后不赞同这样做，说这3周之中细胞已经transformed的很多，现在再做
subculture能拿到成功克隆的几率要比P1开始1：1000 subculture要小得多。请问大家
看法？
另外，同时做control的wt HEK293已经都死了。 |
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发帖数: 1 | 18 最近做luciferase assay，就是把含有疾病相关的snp的promoter跟luciferase连接在
一起，看snp对promoter的影响。假设snp的ref allele是A, 疾病相关的allele是B
我首先在hek293里做，用lipofectamine3000转染。铺板子（12-well）铺了10个孔，5
个用于allele-a, 5个用于allele－b。先把lipo和dna混合好，然后把mix分给每一个孔。
以上是第一次实验，过两天我会一模一样的重复上述实验。
我想请问这里的5个孔中的每一个孔算是biological replicate还是technical
replicate呢？
而这两次实验算是biological replicate还是technical replicate呢？
之所以问这个问题是因为后来面对转染neuron的实验。neuron比较难转染所以用的是
nucleofection，一次性用cuvette转染100万个细胞，然后分到12-well的3个孔中。
同样的实验过两天我也会一模一样的再重复一次。
对于neuron的转染，分到3个孔中的... 阅读全帖 |
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G***G
发帖数: 16778 | 19 your experiments after two days are biological replicate.
five replicates at the same times are technical replicate.
最近做luciferase assay，就是把含有疾病相关的snp的promoter跟luciferase连接在
一起，看snp对promoter的影响。假设snp的ref allele是A, 疾病相关的allele是B
我首先在hek293里做，用lipofectamine3000转染。铺板子（12-well）铺了10个孔，5
个用于allele-a, 5个用于allele－b。先把lipo和dna混合好，然后把mix分给每一个孔。
以上是第一次实验，过两天我会一模一样的重复上述实验。
我想请问这里的5个孔中的每一个孔算是biological replicate还是technical
replicate呢？
而这两次实验算是biological replicate还是technical replicate呢？
之所以问这个问题是因为后来面对转染neur... 阅读全帖 |
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s**********e
发帖数: 2888 | 20 在科研经费上面，共和党都喜欢砍教育经费。威州就一所科研型大学（UW-Madison），
Scott Walker把威大的经费砍了很多，同时又投款好几亿修建球场。LSU的烙印共和党
州长，把LSU的经费也砍了很多，新闻说LSU会丢掉300个教授位置，现在很多LSU的很多
教授在跳槽（一般跳槽的都是做得很好的，做得不好的哪里也没有人要）。
在意识形态上面，共和党的至少某些神棍，是不会喜欢科研的。干细胞的研究，胚胎细
胞的研究，总总所谓的科学伦理问题，都是一些神棍搞起来的。就说威大的例子，共和
党通过法案不准使用HEK293细胞，因为这是一个来自于胚胎的细胞，简直就是一帮没文
化的煞笔。
民主党支持的那些政策，的确就是群魔乱舞，我刚去加州的几年，几乎常常感慨这个州
的很多政策不是一般的脑残和煞笔。但是后来，觉得全魔乱舞的社会，是有很多煞笔，
但是也有很大的包容性，容忍你做科研作不一样的东西，说不一样的话。你也不用担心
丢人，因为比你更煞笔的变态加州到处都是。
这个氛围和其他地方，比如波士顿或者中部，都很不一样。我以前博士老板是东部人，
对我说，他常感叹说，觉得加州作科研的人似乎都很relax... 阅读全帖 |
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J*****w
发帖数: 180 | 21 我朋友正在帮国内厂家物色有领导能力的，有创业精神的专家，在国内药厂组建蛋白质
药物开发部。
A leading China Pharma Company has immediate openings for the following four
leadership positions in its Yantai, China and Singapore sites. Please send
your resume to [email protected] if interested.
Title: Head, Upstream Process Development
Functional Description:
Lead, build and develop a high performance Upstream Process Development
group engaged in mammalian cell culture development for commercial
therapeutic proteins, including subclone/clone sel... 阅读全帖 |
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y*******g
发帖数: 4 | 22 Postdoctoral Research Fellow Position in Institute of Glycomics, Griffith
University, Gold Coast, Australia
Prof Yaoqi Zhou’s group http://sparks-lab.org is built up a strong term for his molecular biology laboratory to interact with his computational laboratory at the Institute for Glycomics, Griffith University, Gold Coast, Australia. Initial exciting discovery in protein expression optimisation, antibiotic inhibitor discovery and protein design leads to the current expansion of the team. We... 阅读全帖 |
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f********n
发帖数: 6465 | 23 NL的日语再好,也还是NL.
整天被迫在研究室里窝着,照看老鼠,照看大肠杆菌,照看HEK293细胞.
唯独无机会和人交流. |
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a***o
发帖数: 129 | 24 Try that alternative protocol in current protocols in molecular biology which
use BES instead of HEPES.I got much higher efficiency than with HEPES, and I
didn't find any obvious toxicity.
Toxicity may also be cell type specific. Regular HEK293 and Hela cell which I
used seem all right with CaP
is |
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D****g
发帖数: 275 | 25 读Paper的时候发现，人们常用Drasophila的细胞共表达转录因子和Promoter Reporter
质粒去检测转录因子对Promoter的作用，我不明白为什么不用Mammalian细胞而是用昆
虫细胞哪？
另一个问题是文章中常用COS细胞表达转录因子，然后提取核蛋白，EMSA检测该蛋白与
Promoter序列的结合，不明白人们为什么倾向于COS细胞而不是别的细胞例如HEK293?
有没有人知道？ |
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a****d
发帖数: 1919 | 26 大家lab里面都会定期检测mycoplasma infection吗？
我们lab的最新指示是：所有的cell line，都要test mycoplasma infection every
month；我常用的293FT，HEK293，3T3 cell,从来没关心过mycoplasma，一样用得很好
，现在对于是否应该每月都花精力test mycoplasma非常怀疑。。。 |
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R*****w
发帖数: 447 | 27 Thank you very much, sunnyday!
I figured it out and found that pcDNA3.1 does have sv40 origin.
The following is some information from Wiki, in case someone else is
interested in this:
HEK 293 cells were generated in early 70s by transformation of cultures of
normal human embryonic kidney cells with sheared adenovirus 5 DNA in Alex
Van der Eb's laboratory in Leiden, Holland.
An important variant of HEK293 cell line is the 293T cell line that contains
, in addition, the SV40 Large T-antigen, that |
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m******5
发帖数: 1383 | 28 Dear all:
I am planing to buy a Diphtheria Toxin resistant cell line for the
convenience of expressing a protein embedded in a DTA expressing construct.
I searched around but end up having no idea.
Does anyone know where I can buy them? Thanks alot!!!!!!!!!
-_- if there is a DTA resistant HEK293 cell line would be perfect |
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z****g
发帖数: 3340 | 29 Phoenix cells that are derived from HEK293 cells and used for making
retrovirus. |
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t********n
发帖数: 64 | 30 你用的什么细胞系，我们实验室一同学用这个在HEK293里头做发现蛋白就是不降解，后
来换了CHO居然work了。。。 |
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b*******3
发帖数: 99 | 31 膜蛋白做Western Blot需要用PNGase F去掉N端糖基?
我现在在做一个膜蛋白的Western Blot,这个膜蛋白的基因序列前辈被我加了一个FLAG
的标签构建立一个表达载体pcDNA3,然后转染到细胞HEK293中.筛选后构建了稳定的细胞系.
免疫染色,药理学都很正常.(如果没有转染成功不会有这么强的药理现象.)
抗FLAG的一抗,做Western Blot却做不出来.
是不是需要用PNGase F去掉N端糖基再做呢?有必要?
PNGase F去掉N-linked carbodydrates?和去糖基是一个意思?
谢谢
N-Glycosidase F (PNGase F) is a ~36 kDa amidase that cleaves at the
innermost N-acetylglucosamine (GlcNAc) and asparagine residues of high
mannose, hybrid, and complex oligosaccharides from N-linked glycoproteins. |
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b*******3
发帖数: 99 | 32 加得进入吗?HEK293细胞被捻碎后?经常都是加了很臭的液体后,就变硬,很难加进入. |
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n******u
发帖数: 418 | 33 转染效率还行，比不上HEK293这种bt cell
不过做做luciferase assay没问题
但是我的ATDC5用来做differentiation就总是不work。。。至今不明原因。。。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 34 There are a lot of immortalize techniques...for example the most common
human kidney cell line Hek293 is an embryonic kidney cell transformed with
adenovirus 5 DNA. Usually the immortalization is included in the cell line
information sheet.
http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/ta |
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d******r
发帖数: 124 | 35 搭车同问，我的质粒13kb，转neuron，磷酸钙，V5 tag染色，效率很低，
共转的GFP倒是很好。在Hek293上试，一切正常。
大侠觉得是什么问题？ |
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q**********0
发帖数: 335 | 36 For example, HEK293 was transformed by Adenovirus protein. |
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c**i
发帖数: 265 | 37 可以啊，至少HEK293可以，我一般用400ng或800ng转100，000cells，没问题的。 |
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D***a
发帖数: 516 | 39 希望找一个能像HEK293一样容易转，但细胞个头要大，能在玻片上铺得开的。
另外问个问题，transfection效率跟细胞的什么性质有关？为什么有的细胞好转，有的
难转？ |
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t*****P
发帖数: 36 | 40 原来师兄用过的质粒，我拿出来重新mini extract后，转HEK293都不表达了。
把分子片段酶切下来，重新连接也还是不行。
请教怎么回事？谢谢大家！祝大家新年快乐！ |
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s*********t
发帖数: 600 | 41 比如，A蛋白和B蛋白在HEK293里面。
mRNA水平当然能比较，蛋白水平呢？
有没有简单可行的办法，还是没有？ |
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l**********t
发帖数: 138 | 42 最近培养293细胞时在显微镜下看到很多空泡样的东西，有没有哪位高手能指点一下这
是怎么回事？
冻的细胞在-80放了有半年，以前都长得挺好的，我现在用的培养基和血清也和以前一
样。不过我们实验室最近从东部搬到了中部，会不会是培养条件改变了？
先谢谢各位了！ |
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a*****x
发帖数: 901 | 46 细胞被stress了会这样。-80度不能放太久的。应该放液氮。 |
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d***s
发帖数: 1062 | 47 关注。
我养的phoenix gp也这样，很容易成团。要每天换液才行，我觉得可能是细胞老了。 |
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a*****x
发帖数: 901 | 48 ER stress 引起autophagy，形成lysosome的vacule。这是最常见的原因。 |
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l**********t
发帖数: 138 | 49 挺有意思的，那是什么原因导致ER stress 的呢？ |
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a*****x
发帖数: 901 | 50 查ER stress 和 autophagy有很多文献的。这里我认为是-80度放太久引起的。本来-80
度就不能用来长期冻存细胞（一般最长不超过1个月）。 |
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