S**********g
发帖数: 109 | 1 提RNA--反转录PCR--realtime PCR，在这其中，提完RNA之后，要不要测RNA浓度吗？在
做反转录PCR之前，要把所有RNA样品调正为同一浓度吗？
有人认为不用，因为在做realtime PCR的时候，有内参作对比，所以不用，但有的人还
是说要调正浓度，到底应不应该调正呐？
谢谢 |
s******r
发帖数: 2876 | 2 你反转录的时候，难道不需要知道加了多少RNA吗？
太多的话，转录反应效率会不会受影响。
【在 S**********g 的大作中提到】
: 提RNA--反转录PCR--realtime PCR，在这其中，提完RNA之后，要不要测RNA浓度吗？在
: 做反转录PCR之前，要把所有RNA样品调正为同一浓度吗？
: 有人认为不用，因为在做realtime PCR的时候，有内参作对比，所以不用，但有的人还
: 是说要调正浓度，到底应不应该调正呐？
: 谢谢
|
S**********g
发帖数: 109 | 3 我对这个不是很懂所以才问，怎么样算是太多？会怎么样影响反转录效率，我一个师姐
告诉我的，提了RNA之后什么也别干快去反转录，不用测浓度因为realtime pcr时有内能
【在 s******r 的大作中提到】
: 你反转录的时候，难道不需要知道加了多少RNA吗？
: 太多的话，转录反应效率会不会受影响。
|
j******n
发帖数: 941 | 4
内能
在一定范围内你师姐说的是对的 尤其是每次提的细胞都差不多的时候 基本可以不测
按照之前的protocol加就行了 你师姐肯定是常做这种scale 心里有数
换一种情况 如果两个样品 一个RNA极端少 一个极端多 在同一个scale的反转中 那个
极端多的样品很可能反转不完全 导致最后结果与实际量比偏少 量太少也可能会导致后
面的PCR反应被背景信号干扰 导致假阳性 结果比实际量偏多 那肯定有就误差了呗
【在 S**********g 的大作中提到】
: 我对这个不是很懂所以才问，怎么样算是太多？会怎么样影响反转录效率，我一个师姐
: 告诉我的，提了RNA之后什么也别干快去反转录，不用测浓度因为realtime pcr时有内能
|
a*******a
发帖数: 4233 | 5 做个realtime那么急急吼吼的干啥
抽完赶紧去反转的目的是保证rna的完整性，主要是保证模板里面大片段不被破坏，以
后拉长基因，做文库好用
你一个realtime检测的是100多bp的东西，怕啥啦
师姐胸大不，不大就按我说的做去测浓度。
万一你没测浓度加了一样的体积去反转录，结果不幸有几个浓度太低反转效率不好，岂
不是要重新收集样品？
内能
【在 S**********g 的大作中提到】
: 我对这个不是很懂所以才问，怎么样算是太多？会怎么样影响反转录效率，我一个师姐
: 告诉我的，提了RNA之后什么也别干快去反转录，不用测浓度因为realtime pcr时有内能
|
w***a
发帖数: 4361 | 6 那要是师姐胸大呢？是不是就可以干脆不测了。。。
【在 a*******a 的大作中提到】
: 做个realtime那么急急吼吼的干啥
: 抽完赶紧去反转的目的是保证rna的完整性，主要是保证模板里面大片段不被破坏，以
: 后拉长基因，做文库好用
: 你一个realtime检测的是100多bp的东西，怕啥啦
: 师姐胸大不，不大就按我说的做去测浓度。
: 万一你没测浓度加了一样的体积去反转录，结果不幸有几个浓度太低反转效率不好，岂
: 不是要重新收集样品？
:
: 内能
|
n********e
发帖数: 1630 | 7 这个问题我遇到过。RNA 到cDNA， 不同的RNA 的浓度影响RT的效率，你可以做个
standard curve， 用一系列浓度，包括你估计的RNA 药品的浓度（通过preliminary的
RT pcr测） 如果你的样品差别不大，就没问题，如果你的样品浓度差别很大。有可能
浓度很低的样品，RT 效率也低。我遇到过。我的经验是 10^9 以上的copy number，
基本可以达到1 RNA 得到 1 cDNA， 但是这个浓度做qPCR 太高。如果是 10^2 - 10^7
copy RNA 做RT，效率会很低，我最好的结果是10%。这个10%是在这个范围内一致的。
所以也没问题。你用的是什么RTase， Superscript III 好一点，另外加点RNAase
inhibitor.
我曾经为这个RT step折腾了很久。。。后来知道，很多人都不这么做，直接拿内参。
。但是确实RT effeiciency在不同浓度是不一样的
【在 S**********g 的大作中提到】
: 提RNA--反转录PCR--realtime PCR，在这其中，提完RNA之后，要不要测RNA浓度吗？在
: 做反转录PCR之前，要把所有RNA样品调正为同一浓度吗？
: 有人认为不用，因为在做realtime PCR的时候，有内参作对比，所以不用，但有的人还
: 是说要调正浓度，到底应不应该调正呐？
: 谢谢
|
a******7
发帖数: 7936 | 8 我做的是测浓度，
按浓度加RNA到反转cDNA的体系里这样出来的cDNA浓度大约就是统一的
一般用Biorad的kit反转出来到1000ng/ul，我在N年前刚做PhD的时候还测过反转出的
cDNA浓度，比较一致的在1000~1100ng/ul之间，此后的N年里再也不测了，cDNA1:10稀
释后做PCR
【在 S**********g 的大作中提到】
: 提RNA--反转录PCR--realtime PCR，在这其中，提完RNA之后，要不要测RNA浓度吗？在
: 做反转录PCR之前，要把所有RNA样品调正为同一浓度吗？
: 有人认为不用，因为在做realtime PCR的时候，有内参作对比，所以不用，但有的人还
: 是说要调正浓度，到底应不应该调正呐？
: 谢谢
|
d****i
发帖数: 2346 | 9 强烈建议你测一下RNA浓度。。。当年做一个实验老是做不出差异来，很郁闷，后来自
己一个人在那里琢磨，去测了一下浓度，然后调整成同一个浓度，重复了一下realtime
，做出了显著差异。被老板狠狠鄙视了一下，至今还不能忘记那时候老板的眼神。。。
。。。。 |
l******a
发帖数: 3339 | 10 现在都是粗放流？
【在 S**********g 的大作中提到】
: 提RNA--反转录PCR--realtime PCR，在这其中，提完RNA之后，要不要测RNA浓度吗？在
: 做反转录PCR之前，要把所有RNA样品调正为同一浓度吗？
: 有人认为不用，因为在做realtime PCR的时候，有内参作对比，所以不用，但有的人还
: 是说要调正浓度，到底应不应该调正呐？
: 谢谢
|
|
|
A******y
发帖数: 2041 | 11 A lot of people do rt-PCR badly. Let's not even talk about how many non-
linear primer in the published articles. Personally, if you are doing
relative C(t), I would always normalize my RNA/cDNA concentration just to
make sure my housekeeping gene is not moving!!! |
i***l
发帖数: 1656 | 12 同意上面几位有具体内容的意见，补充2点，
1. 大多数的实验是要比较不同Sample中的目的基因，所以应该把各个Sample的总RNA量
调成差不多的量
2. 每个RT Kit都会对Input RNA的量有个范围规定，比如我记得Invitrogen的
SuperScript3就是2-10Ug的总RNA吧，你当然不能超出这个范围。 |
o******n
发帖数: 511 | 13 我记得我做的时候是调的。dahuzi那个回复太搞笑了。 |
S**********g
发帖数: 109 | 14 我们用的是SYBR，下次我还是测浓度吧，谢谢
7
【在 n********e 的大作中提到】
: 这个问题我遇到过。RNA 到cDNA， 不同的RNA 的浓度影响RT的效率，你可以做个
: standard curve， 用一系列浓度，包括你估计的RNA 药品的浓度（通过preliminary的
: RT pcr测） 如果你的样品差别不大，就没问题，如果你的样品浓度差别很大。有可能
: 浓度很低的样品，RT 效率也低。我遇到过。我的经验是 10^9 以上的copy number，
: 基本可以达到1 RNA 得到 1 cDNA， 但是这个浓度做qPCR 太高。如果是 10^2 - 10^7
: copy RNA 做RT，效率会很低，我最好的结果是10%。这个10%是在这个范围内一致的。
: 所以也没问题。你用的是什么RTase， Superscript III 好一点，另外加点RNAase
: inhibitor.
: 我曾经为这个RT step折腾了很久。。。后来知道，很多人都不这么做，直接拿内参。
: 。但是确实RT effeiciency在不同浓度是不一样的
|
S**********g
发帖数: 109 | |
s**e
发帖数: 1523 | 16 我做得时候是调的。如果你做得样品浓度一直比较稳定，cDNA都能出来，那么时间长了
也可以省略（虽然我个人不推荐）。我那时候不光测RNA浓度调成一致，还要跑个快胶
看看提出来了没有。迅速的做rtPCR有时候是怕RNA降解。 |
