n**8
发帖数: 221 | 1 想从cDNA文库PCR拉出一条9kb的DNA，可是怎么pcr都不work.
但是这条长的cDNA当中的相互overlap的小片段 （～1kb）都能被P出来。现在怀疑是不
是反转没有得
到全长的cDNA。
请教大侠，一般这种情况该怎么对付？
不甚感激！ |
C*******e
发帖数: 4348 | 2 1.可能没有全长cDNA
2.可能有全长cDNA，但是用的DNA polymerase没办法从你的模板里p 9kb
解决方法可以有
1.如果对cDNA质量有怀疑，重新制备
2.换DNA polymerase，我用过TAKARA的LA DNA polymerase，不过模板不是cDNA，是细
菌gDNA，
扩了13kb。模板是细菌gDNA还是人/老鼠 gDNA还是cDNA还有区别的，可以参考他们网站
3.既然小段的可以P出来，就重新设计引物，分两段或者分三段甚至四段扩，（互相
overlap)分别扩
好了以后再做mega PCR
【在 n**8 的大作中提到】
: 想从cDNA文库PCR拉出一条9kb的DNA，可是怎么pcr都不work.
: 但是这条长的cDNA当中的相互overlap的小片段 （～1kb）都能被P出来。现在怀疑是不
: 是反转没有得
: 到全长的cDNA。
: 请教大侠，一般这种情况该怎么对付？
: 不甚感激！
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c******r
发帖数: 3778 | 3 9kb不算太过分，上面葡萄mm做了13kb，但是9kb确实也比较长，rt可能需要调整一下
protocol。实在不行只能分段pcr，然后接起来
【在 n**8 的大作中提到】
: 想从cDNA文库PCR拉出一条9kb的DNA，可是怎么pcr都不work.
: 但是这条长的cDNA当中的相互overlap的小片段 （～1kb）都能被P出来。现在怀疑是不
: 是反转没有得
: 到全长的cDNA。
: 请教大侠，一般这种情况该怎么对付？
: 不甚感激！
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s******y
发帖数: 28562 | 4 这个不太可能是反转录的问题，更可能的是你克隆PCR的问题，
因为９k有点长的，一般的酶没有那么processive
【在 n**8 的大作中提到】
: 想从cDNA文库PCR拉出一条9kb的DNA，可是怎么pcr都不work.
: 但是这条长的cDNA当中的相互overlap的小片段 （～1kb）都能被P出来。现在怀疑是不
: 是反转没有得
: 到全长的cDNA。
: 请教大侠，一般这种情况该怎么对付？
: 不甚感激！
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n**8
发帖数: 221 | 5 多谢大家的回复
PCR条件还好，因为同样的引物从genomic DNA 中能P出更长的（11kb），这是我的
positive control。
我是怀疑我的RT有问题。 |
n**8
发帖数: 221 | 6 我是想1.） 证明这个长片段cDNA的存在， 现在这个9kb是annotated （估计要做northern)
2.）克隆这个长片段并测序 |
s******y
发帖数: 28562 | 7 如果RT-PCR (oligo-dT做的话) 出了问题的话，那么你用靠近3'-end 和靠近
5'-end 的primer pairs 来作出的PCR 的条带粗细会有比较大的差别。
当然，也可以直接用northen 来证明。
【在 n**8 的大作中提到】
: 多谢大家的回复
: PCR条件还好，因为同样的引物从genomic DNA 中能P出更长的（11kb），这是我的
: positive control。
: 我是怀疑我的RT有问题。
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C*******e
发帖数: 4348 | 8 如果说你需要的只是把这段cDNA扩出来
好作为实验材料进行下面的步骤
就不要去走弯路，证明长片段存在什么的
很多时候生物实验做啊做啊会容易舍本逐末
不过我不了解你的实验哈
就是这么一说
northern)
【在 n**8 的大作中提到】
: 我是想1.） 证明这个长片段cDNA的存在， 现在这个9kb是annotated （估计要做northern)
: 2.）克隆这个长片段并测序
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C*******e
发帖数: 4348 | 9 hoho，承蒙院长还记得偶～
【在 c******r 的大作中提到】
: 9kb不算太过分，上面葡萄mm做了13kb，但是9kb确实也比较长，rt可能需要调整一下
: protocol。实在不行只能分段pcr，然后接起来
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n***w
发帖数: 2405 | 10 原来你是mm。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: hoho，承蒙院长还记得偶～
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n**8
发帖数: 221 | 11 谢谢大家的建议，因为还没有这个长片段的cDNA的证据，所以想先证实是存在的。。。
（香槟葡萄的ID好像很眼熟。。。） |
C*******e
发帖数: 4348 | 12 这个还“原来”
我真是要吐血
【在 n***w 的大作中提到】
: 原来你是mm。。。
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c******r
发帖数: 3778 | 13 是，这完全看lz想干嘛。
如果想clone这个cDNA来表达：那么就是一段一段clone了拼起来好了。
如果想看这个mRNA的表达量：可以northern，或者qPCR，不用管全长啥的。
如果想证明是否全长表达：可以做两个probe，一个在5'，一个在3'，做northern
完全没有必要一次RT全长RNA。
嘻嘻，没想到咱们同行，hand hand，以后mm多多指教
【在 C*******e 的大作中提到】
: 如果说你需要的只是把这段cDNA扩出来
: 好作为实验材料进行下面的步骤
: 就不要去走弯路，证明长片段存在什么的
: 很多时候生物实验做啊做啊会容易舍本逐末
: 不过我不了解你的实验哈
: 就是这么一说
:
: northern)
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n**8
发帖数: 221 | |
c******r
发帖数: 3778 | 15 what？？？
反了吧？测序可以跟DNA上直接测，不用RT那么麻烦。如果一定要测RNA，那可以一段一
段测啊，反正也不能一次读9kb。设计几对sequence sepecific的primers去RT-PCR好了
。设计primer的时候可以在头尾加上内切酶位点，PCR product一半去测序，一半切一
下去克隆。
【在 n**8 的大作中提到】
: 我想要先测序再克隆。
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C*******e
发帖数: 4348 | 16 hand一下
我不去宝宝版了
所以比较少见到你啦
【在 c******r 的大作中提到】
: 是，这完全看lz想干嘛。
: 如果想clone这个cDNA来表达：那么就是一段一段clone了拼起来好了。
: 如果想看这个mRNA的表达量：可以northern，或者qPCR，不用管全长啥的。
: 如果想证明是否全长表达：可以做两个probe，一个在5'，一个在3'，做northern
: 完全没有必要一次RT全长RNA。
: 嘻嘻，没想到咱们同行，hand hand，以后mm多多指教
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n**8
发帖数: 221 | 17 sorry. 讲得有点confusing了。
其实是想请教大家对于反转长片段cDNA的一些技术窍门儿。。。 |
i***l
发帖数: 1656 | 18 你还真是较真儿
问你，光克隆个长的，能发文章不？
买房子讲究Location,搞生物讲究Phenotype，
有了表性才能发文章搞Grant，细枝末节较真儿没有多大意思
你克隆做的再好，有如何？
现在估计花钱都能让公司做克隆了
【在 n**8 的大作中提到】
: sorry. 讲得有点confusing了。
: 其实是想请教大家对于反转长片段cDNA的一些技术窍门儿。。。
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n**8
发帖数: 221 | 19 发不发文章跟克隆长短没有关系，现在早就不是克隆基因的年代了。
可是这个真的跟我做的biological story有关系啊。
呵呵，不较真了。 |
I*********r
发帖数: 8 | 20 在反转录时，不适用random primer，直接使用你的primer，是否可行？
【在 n**8 的大作中提到】
: 想从cDNA文库PCR拉出一条9kb的DNA，可是怎么pcr都不work.
: 但是这条长的cDNA当中的相互overlap的小片段 （～1kb）都能被P出来。现在怀疑是不
: 是反转没有得
: 到全长的cDNA。
: 请教大侠，一般这种情况该怎么对付？
: 不甚感激！
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c******r
发帖数: 3778 | 21 你说说你的story？很多实验技术上有时候会有这样那样的难题。虽然不是不可解决，
但是如果答案比手段更重要的时候，太纠结于一个手段没有必要。想个办法绕过去好了
。关键是这样节省很多时间，咱们自己的青春不是。
如果你一定要RT一段很长的RNA，9kb并非不可能，但是效率比较低，也不是非常
reliable。更重要的是里面可能会有错误。如果你觉得这都不重要，就是把它RT出来最
重要，建议你找找有没有想关的protocols，应该有很多很多。
比如invitrogen的这个kit，就可以rt up to 9kb：
https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.
unitSectionTree&treeNodeId=3DE1D285EC91ED2AA3E282E1D0D52A68
还有qiagen的这个kit，up to12.5kb：
http://www.qiagen.com/products/pcr/longrange/qiagenlongrangepcr
【在 n**8 的大作中提到】
: 发不发文章跟克隆长短没有关系，现在早就不是克隆基因的年代了。
: 可是这个真的跟我做的biological story有关系啊。
: 呵呵，不较真了。
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Z******5
发帖数: 435 | 22 制备cDNA方面可以做的改进：
1，最好直接用gene specfic primer做反转录，延长反转录反应的时间；
2，如果不用1，最好用oligo dT；
3，如果非要用随机引物，最好减少引物用量（参考invitrogen SuperScript Ⅲ说明书） |
n**8
发帖数: 221 | 23 多谢回复！
to院长，
想弄下来测序，看看怎么splicing的，还有看看predicted的motif还在不在，你之前说
的那个分段测序，我已经做过了，可是这并不能说明这个全长的cDNA存在啊？准备做
northern，但是也只能看size，具体的molecular lesion 还是不确定。
你说的这么长PCR出来不reliable，只是先粗测序看看，真正要最终高保真的克隆，当
然会分段做。
to Zifeng9527，
想搞全长的cDNA，自然尽量不会去用random primer 反转。 |
